ເມຕາໂບໄລທ໌ທີ່ກະຕຸ້ນພູມຕ້ານທານແມ່ນລັກສະນະສຳຄັນຂອງສະພາບແວດລ້ອມຈຸລະພາກຂອງເນື້ອງອກ (TME), ແຕ່ມີຂໍ້ຍົກເວັ້ນບາງຢ່າງ, ຕົວຕົນຂອງມັນຍັງບໍ່ທັນຮູ້ເທື່ອ. ໃນທີ່ນີ້, ພວກເຮົາໄດ້ວິເຄາະເນື້ອງອກ ແລະ ເຊວ T ຈາກເນື້ອງອກ ແລະ ນ້ຳໃນຊ່ອງທ້ອງຂອງຄົນເຈັບທີ່ເປັນມະເຮັງເນື້ອງອກລະດັບສູງ (HGSC) ເພື່ອເປີດເຜີຍເມຕາໂບໄລທ໌ຂອງຊ່ອງ TME ທີ່ແຕກຕ່າງກັນເຫຼົ່ານີ້. ນ້ຳໃນຊ່ອງທ້ອງ ແລະ ເຊວເນື້ອງອກມີຄວາມແຕກຕ່າງກັນຂອງເມຕາໂບໄລທ໌ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ. ເມື່ອປຽບທຽບກັບນ້ຳໃນຊ່ອງທ້ອງ, ເຊວ T ທີ່ແຊກຊຶມເຂົ້າໄປໃນເນື້ອງອກຈະອຸດົມໄປດ້ວຍ 1-methylnicotinamide (MNA) ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ. ເຖິງແມ່ນວ່າລະດັບຂອງ MNA ໃນເຊວ T ຈະສູງຂຶ້ນ, ການສະແດງອອກຂອງ nicotinamide N-methyltransferase (ເອນໄຊທີ່ກະຕຸ້ນການໂອນກຸ່ມເມທິລຈາກ S-adenosylmethionine ໄປຫາ nicotinamide) ແມ່ນຈຳກັດຢູ່ໃນ fibroblasts ແລະ ເຊວເນື້ອງອກ. ໃນໜ້າທີ່, MNA ກະຕຸ້ນເຊວ T ໃຫ້ປ່ອຍ cytokine tumor necrosis factor alpha ທີ່ສົ່ງເສີມເນື້ອງອກ. ດັ່ງນັ້ນ, MNA ທີ່ມາຈາກ TME ຈຶ່ງປະກອບສ່ວນເຂົ້າໃນການຄວບຄຸມພູມຕ້ານທານຂອງເຊວ T ແລະ ເປັນຕົວແທນເປົ້າໝາຍການປິ່ນປົວພູມຕ້ານທານທີ່ມີທ່າແຮງສຳລັບການປິ່ນປົວມະເຮັງຂອງມະນຸດ.
ເມຕາໂບໄລທ໌ທີ່ໄດ້ມາຈາກເນື້ອງອກສາມາດມີຜົນກະທົບຕໍ່ການຍັບຍັ້ງຢ່າງເລິກເຊິ່ງຕໍ່ພູມຕ້ານທານຕ້ານເນື້ອງອກ, ແລະຫຼັກຖານຫຼາຍຂຶ້ນເລື້ອຍໆສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າພວກມັນຍັງສາມາດເປັນແຮງຂັບເຄື່ອນທີ່ສຳຄັນສຳລັບຄວາມຄືບໜ້າຂອງພະຍາດ (1). ນອກເໜືອໄປຈາກຜົນກະທົບຂອງ Warburg, ວຽກງານທີ່ຜ່ານມາໄດ້ເລີ່ມຕົ້ນທີ່ຈະອະທິບາຍລັກສະນະສະພາບການເຜົາຜານອາຫານຂອງຈຸລັງເນື້ອງອກ ແລະ ຄວາມສຳພັນຂອງມັນກັບສະພາບພູມຕ້ານທານຂອງສະພາບແວດລ້ອມຈຸລະພາກຂອງເນື້ອງອກ (TME). ການສຶກສາກ່ຽວກັບຕົວແບບໜູ ແລະ ຈຸລັງ T ຂອງມະນຸດໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າການເຜົາຜານອາຫານຂອງ glutamine (2), ການເຜົາຜານອາຫານອົກຊີເດຊັນ (3) ແລະ ການເຜົາຜານນ້ຳຕານ glucose (4) ສາມາດເຮັດໜ້າທີ່ເປັນອິດສະຫຼະຕໍ່ກຸ່ມຍ່ອຍຂອງຈຸລັງພູມຕ້ານທານຕ່າງໆ. ເມຕາໂບໄລທ໌ຫຼາຍຊະນິດໃນເສັ້ນທາງເຫຼົ່ານີ້ຍັບຍັ້ງໜ້າທີ່ຕ້ານເນື້ອງອກຂອງຈຸລັງ T. ມັນໄດ້ຖືກພິສູດແລ້ວວ່າການສະກັດກັ້ນຂອງ coenzyme tetrahydrobiopterin (BH4) ສາມາດທຳລາຍການຂະຫຍາຍຕົວຂອງຈຸລັງ T, ແລະ ການເພີ່ມຂຶ້ນຂອງ BH4 ໃນຮ່າງກາຍສາມາດເສີມຂະຫຍາຍການຕອບສະໜອງພູມຕ້ານທານຕ້ານເນື້ອງອກທີ່ມີ CD4 ແລະ CD8 ເປັນສື່ກາງ. ນອກຈາກນັ້ນ, ຜົນກະທົບທີ່ສະກັດກັ້ນພູມຕ້ານທານຂອງ kynurenine ສາມາດໄດ້ຮັບການຊ່ວຍເຫຼືອໂດຍການບໍລິຫານ BH4 (5). ໃນ glioblastoma ກາຍພັນຂອງ isocitrate dehydrogenase (IDH), ການຫຼั่ง enantiometabolic (R)-2-hydroxyglutarate (R-2-HG) ຍັບຍັ້ງການກະຕຸ້ນ, ການຂະຫຍາຍຕົວ ແລະ ກິດຈະກຳ cytolysis ຂອງຈຸລັງ T (6). ເມື່ອບໍ່ດົນມານີ້, ມັນໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ methylglyoxal, ຜະລິດຕະພັນຂ້າງຄຽງຂອງ glycolysis, ແມ່ນຜະລິດໂດຍຈຸລັງ suppressor ທີ່ມາຈາກ myeloid, ແລະການໂອນ methylglyoxal ຈາກຈຸລັງ T ສາມາດຍັບຍັ້ງການເຮັດວຽກຂອງຈຸລັງ T effector. ໃນການປິ່ນປົວ, ການເປັນກາງຂອງ methylglyoxal ສາມາດເອົາຊະນະກິດຈະກຳຂອງຈຸລັງ suppressor ທີ່ມາຈາກ myeloid (MDSC) ແລະເສີມຂະຫຍາຍການປິ່ນປົວການສະກັດກັ້ນຈຸດກວດໃນແບບຈຳລອງໜູ (7). ການສຶກສາເຫຼົ່ານີ້ຮ່ວມກັນເນັ້ນໜັກເຖິງບົດບາດສຳຄັນຂອງ metabolites ທີ່ມາຈາກ TME ໃນການຄວບຄຸມໜ້າທີ່ ແລະ ກິດຈະກຳຂອງຈຸລັງ T.
ການເຮັດວຽກຜິດປົກກະຕິຂອງເຊວ T ໄດ້ຖືກລາຍງານຢ່າງກວ້າງຂວາງໃນມະເຮັງຮວຍໄຂ່ (8). ສ່ວນໜຶ່ງແມ່ນຍ້ອນລັກສະນະການເຜົາຜານອາຫານທີ່ມີຢູ່ໃນການຂາດອົກຊີເຈນ ແລະ ເສັ້ນເລືອດທີ່ຜິດປົກກະຕິຂອງເນື້ອງອກ (9), ເຊິ່ງສົ່ງຜົນໃຫ້ການປ່ຽນນ້ຳຕານກລູໂຄສ ແລະ ທຣິບໂຕແຟນ ໄປເປັນຜະລິດຕະພັນຂ້າງຄຽງເຊັ່ນ: ກົດແລັກຕິກ ແລະ ໄຄນູເຣນນີນ. ນ້ຳຕານນອກເຊວຫຼາຍເກີນໄປຊ່ວຍຫຼຸດຜ່ອນການຜະລິດອິນເຕີເຟຣອນ-γ (IFN-γ) ແລະ ກະຕຸ້ນການຈຳແນກຂອງກຸ່ມຍ່ອຍທີ່ກົດດັນ myelosuppressive (10, 11). ການບໍລິໂພກທຣິບໂຕແຟນຍັບຍັ້ງການຂະຫຍາຍຕົວຂອງເຊວ T ໂດຍກົງ ແລະ ຍັບຍັ້ງການສົ່ງສັນຍານຂອງຕົວຮັບເຊວ T (12-14). ເຖິງວ່າຈະມີການສັງເກດເຫຼົ່ານີ້, ວຽກງານຫຼາຍຢ່າງທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບການເຜົາຜານອາຫານຂອງພູມຕ້ານທານໄດ້ຖືກປະຕິບັດໃນການເພາະເລี้ยงເຊວ T ໃນຫຼອດທົດລອງໂດຍໃຊ້ສື່ທີ່ດີທີ່ສຸດ, ຫຼື ຈຳກັດຢູ່ໃນຮູບແບບໜູທີ່ຄ້າຍຄືກັນໃນຮ່າງກາຍ, ເຊິ່ງທັງສອງບໍ່ໄດ້ສະທ້ອນເຖິງຄວາມແຕກຕ່າງຂອງມະເຮັງຂອງມະນຸດ ແລະ ສະພາບແວດລ້ອມມະຫາພາກ ແລະ ຈຸລະພາກທາງສະລີລະວິທະຍາຢ່າງເຕັມທີ່.
ລັກສະນະທົ່ວໄປຂອງມະເຮັງຮວຍໄຂ່ແມ່ນການແຜ່ກະຈາຍຂອງຊ່ອງທ້ອງ ແລະ ຮູບລັກສະນະຂອງນ້ຳໃນທ້ອງ. ການສະສົມຂອງນ້ຳໃນຈຸລັງໃນຊ່ອງທ້ອງແມ່ນກ່ຽວຂ້ອງກັບພະຍາດທີ່ກ້າວໜ້າ ແລະ ການພະຍາກອນທີ່ບໍ່ດີ (15). ອີງຕາມລາຍງານ, ຊ່ອງທີ່ເປັນເອກະລັກນີ້ແມ່ນຂາດອົກຊີເຈນ, ມີລະດັບປັດໄຈການເຕີບໂຕຂອງຫຼອດເລືອດ (VEGF) ແລະ indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) ສູງ, ແລະ ຖືກແຊກຊຶມໂດຍຈຸລັງຄວບຄຸມ T ແລະ ຈຸລັງຍັບຍັ້ງ myeloid (15-18). ສະພາບແວດລ້ອມການເຜົາຜານອາຫານຂອງຊ່ອງທ້ອງອາດຈະແຕກຕ່າງຈາກເນື້ອງອກເອງ, ດັ່ງນັ້ນການຂຽນໂປຣແກຣມໃໝ່ຂອງຈຸລັງ T ໃນຊ່ອງທ້ອງຈຶ່ງບໍ່ຊັດເຈນ. ນອກຈາກນັ້ນ, ຄວາມແຕກຕ່າງທີ່ສຳຄັນ ແລະ ຄວາມແຕກຕ່າງລະຫວ່າງຊ່ອງທ້ອງ ແລະ ສານເມຕາໂບໄລທ໌ທີ່ມີຢູ່ໃນສະພາບແວດລ້ອມຂອງເນື້ອງອກອາດຈະຂັດຂວາງການແຊກຊຶມຂອງຈຸລັງພູມຕ້ານທານ ແລະ ໜ້າທີ່ຂອງມັນໃນເນື້ອງອກ, ແລະ ຕ້ອງມີການຄົ້ນຄວ້າຕື່ມອີກ.
ເພື່ອແກ້ໄຂບັນຫາເຫຼົ່ານີ້, ພວກເຮົາໄດ້ອອກແບບວິທີການແຍກຈຸລັງທີ່ມີຄວາມອ່ອນໄຫວ ແລະ ການວິເຄາະດ້ວຍໂຄຣມາໂຕກຣາຟີຂອງແຫຼວແບບ tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) ເພື່ອສຶກສາປະເພດຈຸລັງທີ່ແຕກຕ່າງກັນ (ລວມທັງຈຸລັງ CD4 + ແລະ CD8 + T) ເຊັ່ນດຽວກັນກັບພາຍໃນ ແລະ ລະຫວ່າງເນື້ອງອກ. ສານເມຕາໂບໄລທ໌ຂອງມັນກວມເອົາຈຸລັງໃນນ້ຳໃນຊ່ອງທ້ອງ ແລະ ສະພາບແວດລ້ອມເນື້ອງອກດຽວກັນຂອງຄົນເຈັບ. ພວກເຮົາໃຊ້ວິທີການນີ້ຮ່ວມກັບການວິເຄາະກະແສ cytometry ຂະໜາດສູງ ແລະ ການຈັດລຳດັບ RNA ຈຸລັງດຽວ (scRNA-seq) ເພື່ອໃຫ້ຮູບພາບທີ່ມີຄວາມລະອຽດສູງຂອງສະຖານະພາບການເຜົາຜານອາຫານຂອງກຸ່ມປະຊາກອນທີ່ສຳຄັນເຫຼົ່ານີ້. ວິທີການນີ້ໄດ້ເປີດເຜີຍການເພີ່ມຂຶ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນລະດັບຂອງ 1-methylnicotinamide (MNA) ໃນຈຸລັງ T ເນື້ອງອກ, ແລະ ການທົດລອງໃນຫຼອດທົດລອງສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າຜົນກະທົບຂອງການປັບພູມຕ້ານທານຂອງ MNA ຕໍ່ໜ້າທີ່ຂອງຈຸລັງ T ແມ່ນບໍ່ຮູ້ຈັກມາກ່ອນ. ໂດຍທົ່ວໄປ, ວິທີການນີ້ເປີດເຜີຍການພົວພັນທາງເມຕາໂບໄລທ໌ເຊິ່ງກັນແລະກັນລະຫວ່າງເນື້ອງອກ ແລະ ຈຸລັງພູມຕ້ານທານ, ແລະ ໃຫ້ຄວາມເຂົ້າໃຈທີ່ເປັນເອກະລັກກ່ຽວກັບສານເມຕາໂບໄລທ໌ທີ່ຄວບຄຸມພູມຕ້ານທານ, ເຊິ່ງອາດຈະເປັນປະໂຫຍດສຳລັບການປິ່ນປົວມະເຮັງຮວຍໄຂ່ທີ່ອີງໃສ່ຈຸລັງ T. ໂອກາດການປິ່ນປົວ.
ພວກເຮົາໄດ້ໃຊ້ການວິເຄາະການໄຫຼຂອງໄຊໂຕມິເຕີຂະໜາດສູງເພື່ອວັດແທກການດູດຊຶມນ້ຳຕານໃນເລືອດພ້ອມໆກັນ [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) ແລະ ກິດຈະກຳຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍ [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) ແມ່ນຕົວຊີ້ບອກທົ່ວໄປທີ່ແຍກແຍະຈຸລັງພູມຕ້ານທານ ແລະ ກຸ່ມຈຸລັງເນື້ອງອກ (ຕາຕະລາງ S2 ແລະ ຮູບ S1A). ການວິເຄາະນີ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ ເມື່ອປຽບທຽບກັບຈຸລັງ T, ນ້ຳໃນທ້ອງ ແລະ ຈຸລັງເນື້ອງອກມີລະດັບການດູດຊຶມນ້ຳຕານໃນເລືອດສູງກວ່າ, ແຕ່ມີຄວາມແຕກຕ່າງໜ້ອຍກວ່າໃນກິດຈະກຳຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍ. ການດູດຊຶມນ້ຳຕານໂດຍສະເລ່ຍຂອງຈຸລັງເນື້ອງອກ [CD45-EpCAM (EpCAM)+] ແມ່ນສາມຫາສີ່ເທົ່າຂອງຈຸລັງ T, ແລະ ການດູດຊຶມນ້ຳຕານໂດຍສະເລ່ຍຂອງຈຸລັງ CD4 + T ແມ່ນ 1.2 ເທົ່າຂອງຈຸລັງ CD8 + T, ເຊິ່ງຊີ້ບອກວ່າລິມໂຟໄຊຕ໌ທີ່ແຊກຊຶມເຂົ້າໄປໃນເນື້ອງອກ (TIL) ມີຄວາມຕ້ອງການດ້ານການເຜົາຜານອາຫານທີ່ແຕກຕ່າງກັນ ເຖິງແມ່ນວ່າໃນ TME ດຽວກັນ (ຮູບທີ 1A). ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, ກິດຈະກຳຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍໃນຈຸລັງເນື້ອງອກແມ່ນຄ້າຍຄືກັນກັບຈຸລັງ CD4 + T, ແລະກິດຈະກຳຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍຂອງຈຸລັງທັງສອງຊະນິດແມ່ນສູງກວ່າຈຸລັງ CD8 + T (ຮູບທີ 1B). ໂດຍທົ່ວໄປ, ຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງລະດັບການເຜົາຜານອາຫານ. ກິດຈະກຳການເຜົາຜານອາຫານຂອງຈຸລັງເນື້ອງອກແມ່ນສູງກວ່າຈຸລັງ CD4 + T, ແລະກິດຈະກຳການເຜົາຜານອາຫານຂອງຈຸລັງ CD4 + T ແມ່ນສູງກວ່າຈຸລັງ CD8 + T. ເຖິງວ່າຈະມີຜົນກະທົບເຫຼົ່ານີ້ໃນທົ່ວປະເພດຂອງຈຸລັງ, ແຕ່ບໍ່ມີຄວາມແຕກຕ່າງທີ່ສອດຄ່ອງກັນໃນສະຖານະພາບການເຜົາຜານອາຫານຂອງຈຸລັງ CD4 + ແລະ CD8 + T ຫຼືສັດສ່ວນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງຂອງພວກມັນໃນນ້ຳໃນທ້ອງເມື່ອທຽບກັບເນື້ອງອກ (ຮູບທີ 1C). ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, ໃນສ່ວນຂອງຈຸລັງ CD45, ສັດສ່ວນຂອງຈຸລັງ EpCAM+ ໃນເນື້ອງອກໄດ້ເພີ່ມຂຶ້ນເມື່ອທຽບກັບນ້ຳໃນທ້ອງ (ຮູບທີ 1D). ພວກເຮົາຍັງໄດ້ສັງເກດເຫັນຄວາມແຕກຕ່າງດ້ານການເຜົາຜານອາຫານທີ່ຊັດເຈນລະຫວ່າງອົງປະກອບຂອງຈຸລັງ EpCAM+ ແລະ EpCAM-. ຈຸລັງ EpCAM+ (ເນື້ອງອກ) ມີການດູດຊຶມນ້ຳຕານ ແລະກິດຈະກຳຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍສູງກວ່າຈຸລັງ EpCAM-, ເຊິ່ງສູງກວ່າກິດຈະກຳການເຜົາຜານອາຫານຂອງ fibroblasts ໃນຈຸລັງເນື້ອງອກໃນ TME (ຮູບທີ 1, E ແລະ F).
(A ແລະ B) ຄວາມເຂັ້ມແສງສະເລ່ຍ (MFI) ຂອງການດູດຊຶມນ້ຳຕານໃນເລືອດ (2-NBDG) (A) ແລະ ກິດຈະກຳຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍຂອງຈຸລັງ CD4 + T (MitoTracker ສີແດງເຂັ້ມ) (B) ກຣາຟຕົວແທນ (ຊ້າຍ) ແລະ ຂໍ້ມູນຕາຕະລາງ (ຂວາ), ຈຸລັງ CD8 + T ແລະ ຈຸລັງເນື້ອງອກ EpCAM + CD45 ຈາກນ້ຳໃນຊ່ອງທ້ອງ ແລະ ເນື້ອງອກ. (C) ອັດຕາສ່ວນຂອງຈຸລັງ CD4 + ແລະ CD8 + (ຂອງຈຸລັງ CD3 + T) ໃນນ້ຳໃນຊ່ອງທ້ອງ ແລະ ເນື້ອງອກ. (D) ສັດສ່ວນຂອງຈຸລັງເນື້ອງອກ EpCAM + ໃນນ້ຳໃນຊ່ອງທ້ອງ ແລະ ເນື້ອງອກ (CD45−). (E ແລະ F) ການດູດຊຶມນ້ຳຕານໃນເນື້ອງອກ EpCAM + CD45 ແລະ EpCAM-CD45-matrix (2-NBDG) (E) ແລະ ກິດຈະກຳຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍ (MitoTracker ສີແດງເຂັ້ມ) (F) ກຣາຟຕົວແທນ (ຊ້າຍ) ແລະ ຂໍ້ມູນຕາຕະລາງ (ຂວາ) ນ້ຳໃນຊ່ອງທ້ອງ ແລະ ຈຸລັງເນື້ອງອກ. (G) ກຣາຟຕົວແທນຂອງການສະແດງອອກຂອງ CD25, CD137 ແລະ PD1 ໂດຍການວິເຄາະກະແສໄຊໂຕເມຕຣີ. (H ແລະ I) ການສະແດງອອກຂອງ CD25, CD137 ແລະ PD1 ໃນຈຸລັງ CD4 + T (H) ແລະ ຈຸລັງ CD8 + T (I). (J ແລະ K) phenotypes ທີ່ບໍ່ມີປະສົບການ, ຄວາມຈຳສູນກາງ (Tcm), effector (Teff) ແລະ ຄວາມຈຳ effector (Tem) ໂດຍອີງໃສ່ການສະແດງອອກຂອງ CCR7 ແລະ CD45RO. ຮູບພາບຕົວແທນ (ຊ້າຍ) ແລະ ຂໍ້ມູນຕາຕະລາງ (ຂວາ) ຂອງຈຸລັງ CD4 + T (J) ແລະ ຈຸລັງ CD8 + T (K) ໃນນ້ຳໃນທ້ອງ ແລະ ເນື້ອງອກ. ຄ່າ P ​​ຖືກກຳນົດໂດຍການທົດສອບ t-test ຄູ່ (*P<0.05, **P<0.01 ແລະ ***P<0.001). ເສັ້ນສະແດງຄົນເຈັບທີ່ກົງກັນ (n = 6). FMO, ການເຍືອງແສງລົບໜຶ່ງ; MFI, ຄວາມເຂັ້ມຂອງການເຍືອງແສງສະເລ່ຍ.
ການວິເຄາະຕື່ມອີກໄດ້ເປີດເຜີຍຄວາມແຕກຕ່າງທີ່ສຳຄັນອື່ນໆລະຫວ່າງສະຖານະພາບ phenotype ຂອງເຊລ T ທີ່ມີຄວາມລະອຽດສູງ. ຈຸລັງທີ່ຖືກກະຕຸ້ນ (ຮູບທີ 1, G ຫາ I) ແລະ ໜ່ວຍຄວາມຈຳ effector (ຮູບທີ 1, J ແລະ K) ໃນເນື້ອງອກແມ່ນພົບເລື້ອຍກວ່າຈຸລັງໃນນ້ຳໃນຊ່ອງທ້ອງ (ສັດສ່ວນຂອງຈຸລັງ CD3 + T). ໃນທຳນອງດຽວກັນ, ການວິເຄາະ phenotype ໂດຍການສະແດງອອກຂອງເຄື່ອງໝາຍການກະຕຸ້ນ (CD25 ແລະ CD137) ແລະ ເຄື່ອງໝາຍການສູນເສຍ [ໂປຣຕີນການຕາຍຂອງເຊລທີ່ຖືກໂປຣແກຣມ 1 (PD1)] ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າເຖິງແມ່ນວ່າລັກສະນະການເຜົາຜານອາຫານຂອງກຸ່ມປະຊາກອນເຫຼົ່ານີ້ຈະແຕກຕ່າງກັນ (ຮູບ S1, B ຫາ E), ແຕ່ບໍ່ມີຄວາມແຕກຕ່າງທີ່ສຳຄັນກ່ຽວກັບການເຜົາຜານອາຫານທີ່ສັງເກດເຫັນຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງລະຫວ່າງກຸ່ມຍ່ອຍ naive, effector ຫຼື ໜ່ວຍຄວາມຈຳ (ຮູບ S1, F ຫາ I). ຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້ໄດ້ຮັບການຢືນຢັນໂດຍການໃຊ້ວິທີການຮຽນຮູ້ຂອງເຄື່ອງຈັກເພື່ອກຳນົດ phenotype ຂອງເຊລໂດຍອັດຕະໂນມັດ (21), ເຊິ່ງເປີດເຜີຍຕື່ມອີກວ່າມີຈຸລັງໄຂກະດູກຈຳນວນຫຼວງຫຼາຍ (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) ໃນນ້ຳໃນຊ່ອງທ້ອງຂອງຄົນເຈັບ (ຮູບ S2A). ໃນບັນດາຈຸລັງທຸກປະເພດທີ່ຖືກລະບຸ, ປະຊາກອນຈຸລັງ myeloid ນີ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນການດູດຊຶມນ້ຳຕານ ແລະ ກິດຈະກຳຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍສູງສຸດ (ຮູບ S2, B ຫາ G). ຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້ເນັ້ນໃຫ້ເຫັນເຖິງຄວາມແຕກຕ່າງທາງດ້ານການເຜົາຜານອາຫານທີ່ເຂັ້ມແຂງລະຫວ່າງຈຸລັງຫຼາຍຊະນິດທີ່ພົບໃນນ້ຳໃນທ້ອງ ແລະ ເນື້ອງອກໃນຄົນເຈັບ HGSC.
ສິ່ງທ້າທາຍຫຼັກໃນການເຂົ້າໃຈລັກສະນະການເຜົາຜານອາຫານຂອງ TIL ແມ່ນຄວາມຕ້ອງການທີ່ຈະແຍກຕົວຢ່າງເຊວ T ທີ່ມີຄວາມບໍລິສຸດ, ຄຸນນະພາບ ແລະ ປະລິມານທີ່ພຽງພໍຈາກເນື້ອງອກ. ການສຶກສາຫຼ້າສຸດໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າວິທີການຄັດແຍກ ແລະ ການເສີມສ້າງລູກປັດໂດຍອີງໃສ່ flow cytometry ອາດຈະນໍາໄປສູ່ການປ່ຽນແປງໃນໂປຣໄຟລ໌ການເຜົາຜານອາຫານຂອງເຊວ (22-24). ເພື່ອແກ້ໄຂບັນຫານີ້, ພວກເຮົາໄດ້ເພີ່ມປະສິດທິພາບວິທີການເສີມສ້າງລູກປັດເພື່ອແຍກ ແລະ ແຍກ TIL ຈາກມະເຮັງຮວຍໄຂ່ຂອງມະນຸດທີ່ຖືກຜ່າຕັດກ່ອນການວິເຄາະໂດຍ LC-MS/MS (ເບິ່ງວັດສະດຸ ແລະ ວິທີການ; ຮູບທີ 2A). ເພື່ອປະເມີນຜົນກະທົບໂດຍລວມຂອງໂປໂຕຄອນນີ້ຕໍ່ການປ່ຽນແປງຂອງການເຜົາຜານອາຫານ, ພວກເຮົາໄດ້ປຽບທຽບໂປຣໄຟລ໌ການເຜົາຜານອາຫານຂອງເຊວ T ທີ່ຖືກກະຕຸ້ນໂດຍຜູ້ໃຫ້ທີ່ມີສຸຂະພາບແຂງແຮງຫຼັງຈາກຂັ້ນຕອນການແຍກລູກປັດຂ້າງເທິງກັບເຊວທີ່ບໍ່ໄດ້ແຍກລູກປັດແຕ່ຍັງຄົງຢູ່ໃນນ້ຳກ້ອນ. ການວິເຄາະການຄວບຄຸມຄຸນນະພາບນີ້ພົບວ່າມີຄວາມສຳພັນສູງລະຫວ່າງສອງເງື່ອນໄຂນີ້ (r = 0.77), ແລະ ຄວາມສາມາດໃນການເຮັດຊ້ຳທາງເທັກນິກຂອງກຸ່ມ 86 metabolites ມີຄວາມສາມາດໃນການເຮັດຊ້ຳສູງ (ຮູບທີ 2B). ດັ່ງນັ້ນ, ວິທີການເຫຼົ່ານີ້ສາມາດປະຕິບັດການວິເຄາະເມຕາໂບໄລທ໌ທີ່ຖືກຕ້ອງໃນຈຸລັງທີ່ກຳລັງໄດ້ຮັບການເສີມສ້າງປະເພດຂອງຈຸລັງ, ດັ່ງນັ້ນຈຶ່ງສະໜອງແພລດຟອມທີ່ມີຄວາມລະອຽດສູງທຳອິດສຳລັບການກຳນົດເມຕາໂບໄລທ໌ສະເພາະໃນ HGSC, ດັ່ງນັ້ນຈຶ່ງເຮັດໃຫ້ຜູ້ຄົນມີຄວາມເຂົ້າໃຈທີ່ເລິກເຊິ່ງກວ່າກ່ຽວກັບຄວາມຈຳເພາະຂອງຈຸລັງ ໂປຣແກຣມເມຕາໂບໄລທ໌ທາງເພດ.
(A) ແຜນວາດແຜນວາດຂອງການເສີມສ້າງລູກປັດແມ່ເຫຼັກ. ກ່ອນການວິເຄາະໂດຍ LC-MS/MS, ຈຸລັງຈະໄດ້ຮັບການເສີມສ້າງລູກປັດແມ່ເຫຼັກສາມຮອບຕິດຕໍ່ກັນ ຫຼື ຍັງຄົງຢູ່ໃນນ້ຳກ້ອນ. (B) ຜົນກະທົບຂອງປະເພດການເສີມສ້າງຕໍ່ຄວາມອຸດົມສົມບູນຂອງສານເມຕາໂບໄລ. ຄ່າສະເລ່ຍຂອງການວັດແທກສາມຄັ້ງສຳລັບແຕ່ລະປະເພດການເສີມສ້າງ ± SE. ເສັ້ນສີເທົາສະແດງເຖິງຄວາມສຳພັນ 1:1. ສະຫະສຳພັນພາຍໃນຊັ້ນຮຽນ (ICC) ຂອງການວັດແທກຊ້ຳໆທີ່ສະແດງຢູ່ໃນປ້າຍແກນ. NAD, nicotinamide adenine dinucleotide. (C) ແຜນວາດແຜນວາດຂອງຂະບວນການເຮັດວຽກຂອງການວິເຄາະສານເມຕາໂບໄລຂອງຄົນເຈັບ. ນ້ຳໃນທ້ອງ ຫຼື ເນື້ອງອກຖືກເກັບມາຈາກຄົນເຈັບ ແລະ ເກັບຮັກສາໄວ້ໃນອຸນຫະພູມເຢັນ. ສ່ວນນ້ອຍໆຂອງແຕ່ລະຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກວິເຄາະໂດຍການວິເຄາະ flow cytometry, ໃນຂະນະທີ່ຕົວຢ່າງທີ່ເຫຼືອໄດ້ຮັບການເສີມສ້າງສາມຮອບສຳລັບຈຸລັງ CD4+, CD8+ ແລະ CD45-. ສ່ວນຕ່າງໆຂອງຈຸລັງເຫຼົ່ານີ້ໄດ້ຖືກວິເຄາະໂດຍໃຊ້ LC-MS/MS. (D) ແຜນທີ່ຄວາມຮ້ອນຂອງຄວາມອຸດົມສົມບູນຂອງສານເມຕາໂບໄລທີ່ໄດ້ມາດຕະຖານ. dendrogram ສະແດງເຖິງການຈັດກຸ່ມຂອງ Ward ຂອງໄລຍະຫ່າງ Euclidean ລະຫວ່າງຕົວຢ່າງ. (E) ການວິເຄາະອົງປະກອບຫຼັກ (PCA) ຂອງແຜນທີ່ເມຕາໂບໄລຂອງຕົວຢ່າງ, ສະແດງໃຫ້ເຫັນສາມສຳເນົາຂອງແຕ່ລະຕົວຢ່າງ, ຕົວຢ່າງຈາກຄົນເຈັບຄົນດຽວກັນແມ່ນເຊື່ອມຕໍ່ກັນດ້ວຍເສັ້ນ. (F) PCA ຂອງໂປຣໄຟລ໌ເມຕາໂບໄລຂອງຕົວຢ່າງທີ່ມີເງື່ອນໄຂໃສ່ຄົນເຈັບ (ເຊັ່ນ: ການໃຊ້ຄວາມຊ້ຳຊ້ອນບາງສ່ວນ); ປະເພດຕົວຢ່າງຖືກຈຳກັດໂດຍເປືອກນູນ. PC1, ອົງປະກອບຫຼັກ 1; PC2, ອົງປະກອບຫຼັກ 2.
ຕໍ່ໄປ, ພວກເຮົາໄດ້ນຳໃຊ້ວິທີການເສີມສ້າງນີ້ເພື່ອວິເຄາະສານເມຕາໂບໄລ 99 ຊະນິດໃນສ່ວນປະກອບຂອງເຊວ CD4+, CD8+ ແລະ CD45 ໃນນ້ຳໃນຊ່ອງທ້ອງ ແລະ ເນື້ອງອກຂັ້ນຕົ້ນຂອງຄົນເຈັບ HGSC ຫົກຄົນ (ຮູບທີ 2C, ຮູບທີ S3A ແລະ ຕາຕະລາງ S3 ແລະ S4). ປະຊາກອນທີ່ສົນໃຈກວມເອົາ 2% ຫາ 70% ຂອງຕົວຢ່າງຂະໜາດໃຫຍ່ເດີມຂອງເຊວທີ່ມີຊີວິດ, ແລະ ສັດສ່ວນຂອງເຊວແຕກຕ່າງກັນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍລະຫວ່າງຄົນເຈັບ. ຫຼັງຈາກແຍກລູກປັດອອກແລ້ວ, ສ່ວນປະກອບທີ່ສົນໃຈທີ່ເສີມສ້າງ (CD4+, CD8+ ຫຼື CD45-) ກວມເອົາຫຼາຍກວ່າ 85% ຂອງເຊວທີ່ມີຊີວິດທັງໝົດໃນຕົວຢ່າງໂດຍສະເລ່ຍ. ວິທີການເສີມສ້າງນີ້ຊ່ວຍໃຫ້ພວກເຮົາສາມາດວິເຄາະປະຊາກອນເຊວຈາກການເຜົາຜານເນື້ອເຍື່ອເນື້ອງອກຂອງມະນຸດ, ເຊິ່ງເປັນໄປບໍ່ໄດ້ຈາກຕົວຢ່າງຂະໜາດໃຫຍ່. ໂດຍການໃຊ້ໂປໂຕຄອນນີ້, ພວກເຮົາໄດ້ກຳນົດວ່າ l-kynurenine ແລະ adenosine, ສານເມຕາໂບໄລທີ່ສະກັດກັ້ນພູມຕ້ານທານສອງຊະນິດນີ້ມີລັກສະນະດີໄດ້ຖືກເພີ່ມຂຶ້ນໃນເຊວ T ເນື້ອງອກ ຫຼື ເຊວເນື້ອງອກ (ຮູບທີ S3, B ແລະ C). ດັ່ງນັ້ນ, ຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງຄວາມຖືກຕ້ອງ ແລະ ຄວາມສາມາດຂອງເທັກໂນໂລຢີການແຍກເຊວ ແລະ ການວິເຄາະມວນສານຂອງພວກເຮົາເພື່ອຊອກຫາສານເມຕາໂບໄລທີ່ສຳຄັນທາງຊີວະພາບໃນເນື້ອເຍື່ອຂອງຄົນເຈັບ.
ການວິເຄາະຂອງພວກເຮົາຍັງໄດ້ເປີດເຜີຍໃຫ້ເຫັນເຖິງການແຍກຕົວຂອງເຊວທີ່ແຕກຕ່າງກັນພາຍໃນ ແລະ ລະຫວ່າງຄົນເຈັບ (ຮູບທີ 2D ແລະ ຮູບທີ S4A). ໂດຍສະເພາະ, ເມື່ອທຽບກັບຄົນເຈັບຄົນອື່ນໆ, ຄົນເຈັບ 70 ສະແດງໃຫ້ເຫັນລັກສະນະການເຜົາຜານອາຫານທີ່ແຕກຕ່າງກັນ (ຮູບທີ 2E ແລະ ຮູບທີ S4B), ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າອາດຈະມີຄວາມແຕກຕ່າງທາງດ້ານການເຜົາຜານອາຫານທີ່ສຳຄັນລະຫວ່າງຄົນເຈັບ. ເປັນທີ່ໜ້າສັງເກດວ່າເມື່ອທຽບກັບຄົນເຈັບຄົນອື່ນໆ (1.2 ຫາ 2 ລິດ; ຕາຕະລາງ S1), ປະລິມານທັງໝົດຂອງນ້ຳໃນທ້ອງທີ່ເກັບໄດ້ໃນຄົນເຈັບ 70 (80 ມລ) ແມ່ນນ້ອຍກວ່າ. ການຄວບຄຸມຄວາມແຕກຕ່າງລະຫວ່າງຄົນເຈັບໃນລະຫວ່າງການວິເຄາະອົງປະກອບຫຼັກ (ຕົວຢ່າງ, ການໃຊ້ການວິເຄາະສ່ວນເກີນບາງສ່ວນ) ສະແດງໃຫ້ເຫັນການປ່ຽນແປງທີ່ສອດຄ່ອງກັນລະຫວ່າງປະເພດເຊວ, ແລະປະເພດເຊວ ແລະ/ຫຼື ສະພາບແວດລ້ອມຈຸນລະພາກແມ່ນລວມເຂົ້າກັນຢ່າງຈະແຈ້ງຕາມໂປຣໄຟລ໌ການເຜົາຜານອາຫານ (ຮູບທີ 2F). ການວິເຄາະການເຜົາຜານອາຫານດ່ຽວໄດ້ເນັ້ນໜັກເຖິງຜົນກະທົບເຫຼົ່ານີ້ ແລະ ເປີດເຜີຍຄວາມແຕກຕ່າງທີ່ສຳຄັນລະຫວ່າງປະເພດເຊວ ແລະ ສະພາບແວດລ້ອມຈຸນລະພາກ. ເປັນທີ່ໜ້າສັງເກດວ່າຄວາມແຕກຕ່າງທີ່ຮຸນແຮງທີ່ສຸດທີ່ສັງເກດເຫັນແມ່ນ MNA, ເຊິ່ງປົກກະຕິແລ້ວຈະອຸດົມໄປດ້ວຍເຊວ CD45- ແລະ ໃນເຊວ CD4+ ແລະ CD8+ ທີ່ແຊກຊຶມເຂົ້າໄປໃນເນື້ອງອກ (ຮູບທີ 3A). ສຳລັບຈຸລັງ CD4+, ຜົນກະທົບນີ້ແມ່ນເຫັນໄດ້ຊັດເຈນທີ່ສຸດ, ແລະ MNA ໃນຈຸລັງ CD8+ ກໍ່ເບິ່ງຄືວ່າໄດ້ຮັບຜົນກະທົບຢ່າງໜັກຈາກສິ່ງແວດລ້ອມ. ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ສິ່ງນີ້ບໍ່ສຳຄັນ, ເພາະວ່າມີພຽງສາມໃນຫົກຄົນເຈັບເທົ່ານັ້ນທີ່ສາມາດປະເມີນຄະແນນ CD8+ ຂອງເນື້ອງອກໄດ້. ນອກເໜືອໄປຈາກ MNA, ໃນຈຸລັງປະເພດຕ່າງໆໃນນ້ຳໃນທ້ອງ ແລະ ເນື້ອງອກ, ສານເຜົາຜານອື່ນໆທີ່ມີຄຸນລັກສະນະບໍ່ດີໃນ TIL ກໍ່ມີຄວາມອຸດົມສົມບູນແຕກຕ່າງກັນ (ຮູບ S3 ແລະ S4). ດັ່ງນັ້ນ, ຂໍ້ມູນເຫຼົ່ານີ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງຊຸດສານເຜົາຜານພູມຕ້ານທານທີ່ມີຄວາມຫວັງສຳລັບການຄົ້ນຄວ້າຕື່ມອີກ.
(A) ເນື້ອໃນປົກກະຕິຂອງ MNA ໃນຈຸລັງ CD4+, CD8+ ແລະ CD45- ຈາກນ້ຳໃນທ້ອງ ແລະ ເນື້ອງອກ. ແຜນວາດກ່ອງສະແດງໃຫ້ເຫັນຄ່າກາງ (ເສັ້ນ), ຂອບເຂດລະຫວ່າງຄວາໄທ (ຂອບພັບ) ແລະ ຂອບເຂດຂໍ້ມູນ, ສູງເຖິງ 1.5 ເທົ່າຂອງຂອບເຂດລະຫວ່າງຄວາໄທ (ຂອບ whisker). ດັ່ງທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ໃນວັດສະດຸ ແລະ ວິທີການຂອງຄົນເຈັບ, ໃຫ້ໃຊ້ຄ່າ limma ຂອງຄົນເຈັບເພື່ອກຳນົດຄ່າ P (*P<0.05 ແລະ **P<0.01). (B) ແຜນວາດແຜນວາດຂອງການເຜົາຜານ MNA (60). ສານເຜົາຜານ: S-adenosyl-1-methionine; SAH, S-adenosine-1-homocysteine; NA, nicotinamide; MNA, 1-methylnicotinamide; 2-PY, 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide; 4-PY, 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide; NR, nicotinamide ribose; NMN, nicotinamide mononucleotide. ເອນໄຊມ໌ (ສີຂຽວ): NNMT, nicotinamide N-methyltransferase; SIRT, sirtuins; NAMPT, nicotinamide phosphoribosyl transferase; AOX1, aldehyde oxidase 1; NRK, nicotinamide riboside kinase; NMNAT, nicotinamide mono Nucleotide adenylate transferase; Pnp1, purine nucleoside phosphorylase. (C) t-SNE ຂອງ scRNA-seq ຂອງ ascites (ສີເທົາ) ແລະ tumor (ສີແດງ; n = 3 ຄົນເຈັບ). (D) ການສະແດງອອກຂອງ NNMT ໃນກຸ່ມຈຸລັງທີ່ແຕກຕ່າງກັນທີ່ລະບຸໂດຍໃຊ້ scRNA-seq. (E) ການສະແດງອອກຂອງ NNMT ແລະ AOX1 ໃນ SK-OV-3, ໝາກໄຂ່ຫຼັງຂອງຕົວອ່ອນຂອງມະນຸດ (HEK) 293T, ເຊວ T ແລະ ເຊວ T ທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ MNA. ການສະແດງອອກທີ່ພັບແລ້ວແມ່ນສະແດງໃຫ້ເຫັນທຽບກັບ SK-OV-3. ຮູບແບບການສະແດງອອກດ້ວຍ SEM ແມ່ນສະແດງໃຫ້ເຫັນ (n = 6 ຜູ້ໃຫ້ທີ່ມີສຸຂະພາບດີ). ຄ່າ Ct ທີ່ຫຼາຍກວ່າ 35 ຖືວ່າບໍ່ສາມາດກວດພົບໄດ້ (UD). (F) ການສະແດງອອກຂອງ SLC22A1 ແລະ SLC22A2 ໃນ SK-OV-3, HEK293T, ເຊວ T ແລະ ເຊວ T ທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ 8mM MNA. ການສະແດງອອກທີ່ພັບແລ້ວແມ່ນສະແດງໃຫ້ເຫັນທຽບກັບ SK-OV-3. ຮູບແບບການສະແດງອອກທີ່ມີ SEM ແມ່ນສະແດງໃຫ້ເຫັນ (n = 6 ຜູ້ໃຫ້ທີ່ມີສຸຂະພາບດີ). ຄ່າ Ct ທີ່ຫຼາຍກວ່າ 35 ແມ່ນຖືວ່າບໍ່ສາມາດກວດພົບໄດ້ (UD). (G) ປະລິມານ MNA ຂອງເຊວໃນເຊວ T ຜູ້ໃຫ້ທີ່ມີສຸຂະພາບດີທີ່ຖືກກະຕຸ້ນຫຼັງຈາກ 72 ຊົ່ວໂມງຂອງການຟັກດ້ວຍ MNA. ຮູບແບບການສະແດງອອກທີ່ມີ SEM ແມ່ນສະແດງໃຫ້ເຫັນ (n = 4 ຜູ້ໃຫ້ທີ່ມີສຸຂະພາບດີ).
MNA ແມ່ນຜະລິດໂດຍການຖ່າຍໂອນກຸ່ມ methyl ຈາກ S-adenosyl-1-methionine (SAM) ໄປຫາ nicotinamide (NA) ໂດຍ nicotinamide N-methyltransferase (NNMT; ຮູບທີ 3B). NNMT ມີການສະແດງອອກຫຼາຍເກີນໄປໃນມະເຮັງຂອງມະນຸດຫຼາຍຊະນິດ ແລະ ກ່ຽວຂ້ອງກັບການຂະຫຍາຍຕົວ, ການບຸກລຸກ ແລະ ການແຜ່ກະຈາຍ (25-27). ເພື່ອເຂົ້າໃຈແຫຼ່ງທີ່ມາຂອງ MNA ໃນຈຸລັງ T ໃນ TME ໃຫ້ດີຂຶ້ນ, ພວກເຮົາໄດ້ໃຊ້ scRNA-seq ເພື່ອອະທິບາຍລັກສະນະຂອງການສະແດງອອກຂອງ NNMT ໃນທົ່ວປະເພດຂອງຈຸລັງໃນນ້ຳໃນທ້ອງ ແລະ ເນື້ອງອກຂອງຄົນເຈັບ HGSC ສາມຄົນ (ຕາຕະລາງ S5). ການວິເຄາະປະມານ 6,500 ຈຸລັງສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າໃນສະພາບແວດລ້ອມຂອງນ້ຳໃນທ້ອງ ແລະ ເນື້ອງອກ, ການສະແດງອອກຂອງ NNMT ຖືກຈຳກັດຕໍ່ປະຊາກອນຈຸລັງ fibroblast ແລະ ຈຸລັງເນື້ອງອກທີ່ສົມມຸດຕິຖານ (ຮູບທີ 3, C ແລະ D). ມັນເປັນສິ່ງທີ່ໜ້າສັງເກດວ່າບໍ່ມີການສະແດງອອກຂອງ NNMT ທີ່ຊັດເຈນໃນປະຊາກອນໃດໆທີ່ສະແດງອອກ PTPRC (CD45 +) (ຮູບທີ 3D ແລະ ຮູບທີ S5A), ເຊິ່ງຊີ້ບອກວ່າ MNA ທີ່ກວດພົບໃນສະເປກຕຣຳ metabolite ໄດ້ຖືກນຳເຂົ້າສູ່ຈຸລັງ T. ການສະແດງອອກຂອງ aldehyde oxidase 1 (AOX1) ປ່ຽນ MNA ໄປເປັນ 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide (2-PYR) ຫຼື 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide (4-PYR); ຮູບທີ 3B) ຍັງຖືກຈຳກັດຢູ່ໃນກຸ່ມ fibroblast ທີ່ສະແດງອອກ COL1A1 (ຮູບ S5A), ເຊິ່ງລວມກັນຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າຈຸລັງ T ຂາດຄວາມສາມາດໃນການເຜົາຜານ MNA ແບບທຳມະດາ. ຮູບແບບການສະແດງອອກຂອງ gene ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ MNA ເຫຼົ່ານີ້ໄດ້ຖືກຢັ້ງຢືນໂດຍໃຊ້ຊຸດຂໍ້ມູນຈຸລັງເອກະລາດອັນທີສອງຈາກ ascites ຈາກຄົນເຈັບ HGSC (ຮູບ S5B; n = 6) (16). ນອກຈາກນັ້ນ, ການວິເຄາະປະຕິກິລິຍາລະບົບຕ່ອງໂສ້ polymerase ປະລິມານ (qPCR) ຂອງຈຸລັງ T ຜູ້ໃຫ້ທີ່ມີສຸຂະພາບດີທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ MNA ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າເມື່ອທຽບກັບຈຸລັງເນື້ອງອກຮວຍໄຂ່ SK-OV-3 ຄວບຄຸມ, NNMT ຫຼື AOX1 ເກືອບບໍ່ໄດ້ສະແດງອອກ (ຮູບທີ 3E). ຜົນໄດ້ຮັບທີ່ບໍ່ຄາດຄິດເຫຼົ່ານີ້ຊີ້ບອກວ່າ MNA ອາດຈະຖືກປ່ອຍອອກມາຈາກ fibroblasts ຫຼືເນື້ອງອກເຂົ້າໄປໃນຈຸລັງ T ທີ່ຢູ່ຕິດກັນໃນ TME.
ເຖິງແມ່ນວ່າຜູ້ສະໝັກປະກອບມີຄອບຄົວຂອງຕົວຂົນສົ່ງ cation ອິນຊີ 1 ຫາ 3 (OCT1, OCT2 ແລະ OCT3) ທີ່ຖືກເຂົ້າລະຫັດໂດຍຄອບຄົວຕົວຂົນສົ່ງທີ່ລະລາຍ 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 ແລະ SLC22A3), ຕົວຂົນສົ່ງທີ່ມີທ່າແຮງຂອງ MNA ຍັງບໍ່ທັນໄດ້ກຳນົດ (28). QPCR ຂອງ mRNA ຈາກຈຸລັງ T ຜູ້ໃຫ້ທີ່ມີສຸຂະພາບດີສະແດງໃຫ້ເຫັນລະດັບການສະແດງອອກຕ່ຳຂອງ SLC22A1 ແຕ່ບໍ່ສາມາດກວດພົບລະດັບຂອງ SLC22A2, ເຊິ່ງຢືນຢັນວ່າມັນໄດ້ຖືກລາຍງານມາກ່ອນໃນເອກະສານ (ຮູບທີ 3F) (29). ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, ສາຍຈຸລັງເນື້ອງອກຮວຍໄຂ່ SK-OV-3 ສະແດງລະດັບສູງຂອງຕົວຂົນສົ່ງທັງສອງ (ຮູບທີ 3F).
ເພື່ອທົດສອບຄວາມເປັນໄປໄດ້ຂອງຈຸລັງ T ທີ່ມີຄວາມສາມາດໃນການດູດຊຶມ MNA ຈາກຕ່າງປະເທດ, ຈຸລັງ T ຜູ້ໃຫ້ທີ່ມີສຸຂະພາບດີໄດ້ຖືກเพาะเลี้ยงເປັນເວລາ 72 ຊົ່ວໂມງໃນສະພາບທີ່ມີຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ MNA ທີ່ແຕກຕ່າງກັນ. ໃນເວລາທີ່ບໍ່ມີ MNA ພາຍນອກ, ເນື້ອໃນຂອງຈຸລັງຂອງ MNA ບໍ່ສາມາດກວດພົບໄດ້ (ຮູບທີ 3G). ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ຈຸລັງ T ທີ່ຖືກກະຕຸ້ນທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ MNA ພາຍນອກສະແດງໃຫ້ເຫັນການເພີ່ມຂຶ້ນຂອງປະລິມານ MNA ໃນຈຸລັງ, ສູງເຖິງ 6 mM MNA (ຮູບທີ 3G). ຜົນໄດ້ຮັບນີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າເຖິງວ່າຈະມີລະດັບການສະແດງອອກຂອງຕົວຂົນສົ່ງທີ່ຕໍ່າ ແລະ ການຂາດເອນໄຊຫຼັກທີ່ຮັບຜິດຊອບຕໍ່ການເຜົາຜານ MNA ພາຍໃນຈຸລັງ, TIL ຍັງສາມາດດູດຊຶມ MNA ໄດ້.
ລະດັບຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງສານເມຕາໂບໄລໃນຈຸລັງ T ຂອງຄົນເຈັບ ແລະ ການທົດລອງການດູດຊຶມ MNA ໃນຫຼອດທົດລອງ ເພີ່ມຄວາມເປັນໄປໄດ້ທີ່ຈຸລັງ fibroblast ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບມະເຮັງ (CAF) ຈະຫຼั่ง MNA ແລະ ຈຸລັງເນື້ອງອກອາດຈະຄວບຄຸມລັກສະນະ ແລະ ໜ້າທີ່ຂອງ TIL. ເພື່ອກຳນົດຜົນກະທົບຂອງ MNA ຕໍ່ຈຸລັງ T, ຈຸລັງຜູ້ໃຫ້ທີ່ມີສຸຂະພາບດີໄດ້ຖືກກະຕຸ້ນໃນຫຼອດທົດລອງໃນເວລາທີ່ມີ ຫຼື ບໍ່ມີ MNA, ແລະ ການຂະຫຍາຍຕົວ ແລະ ການຜະລິດ cytokine ຂອງພວກມັນໄດ້ຖືກປະເມີນ. ຫຼັງຈາກ 7 ມື້ຂອງການເພີ່ມ MNA ໃນປະລິມານສູງສຸດ, ຈຳນວນປະຊາກອນເພີ່ມຂຶ້ນສອງເທົ່າໄດ້ຫຼຸດລົງປານກາງ, ໃນຂະນະທີ່ຄວາມແຂງແຮງຍັງຄົງຢູ່ໃນທຸກໆປະລິມານ (ຮູບທີ 4A). ນອກຈາກນັ້ນ, ການປິ່ນປົວ MNA ຈາກພາຍນອກເຮັດໃຫ້ສັດສ່ວນຂອງຈຸລັງ CD4 + ແລະ CD8 + T ທີ່ສະແດງອອກ tumor necrosis factor-α (TNFα; ຮູບທີ 4B). ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, ການຜະລິດພາຍໃນຈຸລັງຂອງ IFN-γ ໄດ້ຫຼຸດລົງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນຈຸລັງ CD4 + T, ແຕ່ບໍ່ແມ່ນໃນຈຸລັງ CD8 + T, ແລະບໍ່ມີການປ່ຽນແປງທີ່ສຳຄັນໃນ interleukin 2 (IL-2; ຮູບທີ 4, C ແລະ D). ດັ່ງນັ້ນ, ການວິເຄາະດ້ວຍ enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ຂອງ supernatants ຈາກການເພາະເລี้ยงຈຸລັງ T ທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ MNA ເຫຼົ່ານີ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນການເພີ່ມຂຶ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນ TNFα, ການຫຼຸດລົງຂອງ IFN-γ, ແລະບໍ່ມີການປ່ຽນແປງໃນ IL-2 (ຮູບທີ 4, E ຫາ G). . ການຫຼຸດລົງຂອງ IFN-γ ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າ MNA ອາດມີບົດບາດໃນການຍັບຍັ້ງກິດຈະກຳຕ້ານເນື້ອງອກຂອງຈຸລັງ T. ເພື່ອຈຳລອງຜົນກະທົບຂອງ MNA ຕໍ່ຄວາມເປັນພິດຂອງຈຸລັງ T, ຈຸລັງ chimeric antigen receptor T (FRα-CAR-T) ທີ່ແນໃສ່ folate receptor α ແລະ CAR-T (GFP) ທີ່ຄວບຄຸມໂດຍຈຸລັງໂປຣຕີນ fluorescent ສີຂຽວ (GFP) -CAR-T) ແມ່ນຜະລິດໂດຍຈຸລັງ mononuclear ເລືອດຂອງຜູ້ບໍລິຈາກທີ່ມີສຸຂະພາບດີ (PBMC). ຈຸລັງ CAR-T ໄດ້ຖືກເພາະເລี้ยงເປັນເວລາ 24 ຊົ່ວໂມງໃນທີ່ປະທັບຂອງ MNA, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນໄດ້เพาะเลี้ยงຮ່ວມກັບຈຸລັງເນື້ອງອກຮວຍໄຂ່ SK-OV-3 ຂອງມະນຸດທີ່ສະແດງອອກ folate receptor α ໃນອັດຕາສ່ວນ effector ຕໍ່ເປົ້າໝາຍ 10:1. ການປິ່ນປົວດ້ວຍ MNA ເຮັດໃຫ້ກິດຈະກຳການຂ້າຂອງຈຸລັງ FRα-CAR-T ຫຼຸດລົງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ, ເຊິ່ງຄ້າຍຄືກັນກັບຈຸລັງ FRα-CAR-T ທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ adenosine (ຮູບທີ 4H).
(A) ຈຳນວນຈຸລັງທີ່ມີຊີວິດທັງໝົດ ແລະ ການເພີ່ມຂຶ້ນຂອງປະຊາກອນສອງເທົ່າ (PD) ໂດຍກົງຈາກການເພາະເລี้ยงໃນມື້ທີ 7. ກຣາຟແທ່ງສະແດງຄ່າສະເລ່ຍ + SEM ຂອງຜູ້ໃຫ້ທີ່ມີສຸຂະພາບແຂງແຮງຫົກຄົນ. ສະແດງຂໍ້ມູນຈາກການທົດລອງເອກະລາດຢ່າງໜ້ອຍ n = 3 ຄັ້ງ. (B ຫາ D) CD3/CD28 ແລະ IL-2 ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອກະຕຸ້ນຈຸລັງ T ທີ່ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ MNA ຂອງເຂົາເຈົ້າເປັນເວລາ 7 ມື້. ກ່ອນການວິເຄາະ, ຈຸລັງໄດ້ຖືກກະຕຸ້ນດ້ວຍ PMA/ionomycin ດ້ວຍ GolgiStop ເປັນເວລາ 4 ຊົ່ວໂມງ. ການສະແດງອອກຂອງ TNFα (B) ໃນຈຸລັງ T. ຮູບພາບຕົວຢ່າງ (ຊ້າຍ) ແລະ ຂໍ້ມູນຕາຕະລາງ (ຂວາ) ຂອງການສະແດງອອກຂອງ TNFα ໃນຈຸລັງທີ່ມີຊີວິດ. ການສະແດງອອກ IFN-γ (C) ແລະ IL-2 (D) ໃນຈຸລັງ T. ການສະແດງອອກຂອງ cytokines ໄດ້ຖືກວັດແທກໂດຍ flow cytometry. ກຣາຟແທ່ງສະແດງຄ່າສະເລ່ຍ (n = 6 ຜູ້ໃຫ້ທີ່ມີສຸຂະພາບແຂງແຮງ) + SEM. ໃຊ້ການວິເຄາະທາງດຽວຂອງຄວາມແปรປ່ວນ ແລະ ການວັດແທກຊ້ຳໆ (*P<0.05 ແລະ **P<0.01) ເພື່ອກໍານົດຄ່າ P. ສະແດງຂໍ້ມູນຈາກການທົດລອງເອກະລາດຢ່າງໜ້ອຍ n = 3 ຄັ້ງ. (E ຫາ G) CD3/CD28 ແລະ IL-2 ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອກະຕຸ້ນຈຸລັງ T ໃນຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ MNA ຂອງເຂົາເຈົ້າເປັນເວລາ 7 ມື້. ສື່ກາງໄດ້ຖືກເກັບກ່ອນ ແລະ ຫຼັງການກະຕຸ້ນ PMA/ionomycin ເປັນເວລາ 4 ຊົ່ວໂມງ. ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ TNFα (E), IFN-γ (F) ແລະ IL-2 (G) ໄດ້ຖືກວັດແທກໂດຍ ELISA. ກຣາຟແທ່ງສະແດງເຖິງຄ່າສະເລ່ຍ (n = 5 ຜູ້ໃຫ້ທີ່ມີສຸຂະພາບແຂງແຮງ) + SEM. ຄ່າ P ຖືກກຳນົດໂດຍໃຊ້ການວິເຄາະຄວາມແปรປ່ວນທາງດຽວ ແລະ ການວັດແທກຊ້ຳໆ (*P<0.05). ເສັ້ນປະສະແດງເຖິງຂີດຈຳກັດການກວດພົບຂອງການກວດຫາ. (H) ການວິເຄາະການລະລາຍຈຸລັງ. ຈຸລັງ FRα-CAR-T ຫຼື GFP-CAR-T ໄດ້ຖືກປັບດ້ວຍ adenosine (250μM) ຫຼື MNA (10 mM) ເປັນເວລາ 24 ຊົ່ວໂມງ, ຫຼື ປະໄວ້ໂດຍບໍ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວ (Ctrl). ເປີເຊັນການຂ້າຈຸລັງ SK-OV-3 ໄດ້ຖືກວັດແທກ. ຄ່າ P ຖືກກຳນົດໂດຍການທົດສອບ Welch t (*P<0.5 ແລະ **P<0.01).
ເພື່ອໃຫ້ມີຄວາມເຂົ້າໃຈກ່ຽວກັບກົນໄກກ່ຽວກັບການຄວບຄຸມການສະແດງອອກຂອງ TNFα ທີ່ຂຶ້ນກັບ MNA, ການປ່ຽນແປງໃນ mRNA ຂອງ TNFα ຂອງຈຸລັງ T ທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ MNA ໄດ້ຖືກປະເມີນ (ຮູບທີ 5A). ຈຸລັງ T ຜູ້ໃຫ້ທີ່ມີສຸຂະພາບດີທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ MNA ສະແດງໃຫ້ເຫັນການເພີ່ມຂຶ້ນສອງເທົ່າຂອງລະດັບການຖອດລະຫັດ TNFα, ຊີ້ບອກວ່າ MNA ແມ່ນຂຶ້ນກັບການຄວບຄຸມການຖອດລະຫັດ TNFα. ເພື່ອສືບສວນກົນໄກການຄວບຄຸມທີ່ເປັນໄປໄດ້ນີ້, ສອງປັດໄຈການຖອດລະຫັດທີ່ຮູ້ຈັກທີ່ຄວບຄຸມ TNFα, ຄືປັດໄຈນິວເຄຼຍຂອງຈຸລັງ T ທີ່ກະຕຸ້ນ (NFAT) ແລະໂປຣຕີນສະເພາະ 1 (Sp1), ໄດ້ຖືກປະເມີນເພື່ອຕອບສະໜອງຕໍ່ການຜູກມັດຂອງ MNA ກັບໂປຣໂມເຕີ TNFα ທີ່ໃກ້ຊິດ (30). ໂປຣໂມເຕີ TNFα ປະກອບດ້ວຍ 6 ຈຸດຜູກມັດ NFAT ທີ່ລະບຸ ແລະ 2 ຈຸດຜູກມັດ Sp1, ເຊິ່ງຊ້ອນກັນຢູ່ບ່ອນດຽວ [-55 ຄູ່ເບສ (bp) ຈາກ 5'cap] (30). Chromatin immunoprecipitation (ChIP) ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າເມື່ອໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ MNA, ການຜູກມັດຂອງ Sp1 ກັບໂປຣໂມເຕີ TNFα ເພີ່ມຂຶ້ນສາມເທົ່າ. ການລວມຕົວຂອງ NFAT ຍັງເພີ່ມຂຶ້ນ ແລະ ມີຄວາມສຳຄັນຫຼາຍຂຶ້ນ (ຮູບທີ 5B). ຂໍ້ມູນເຫຼົ່ານີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າ MNA ຄວບຄຸມການສະແດງອອກຂອງ TNFα ຜ່ານການຖອດລະຫັດ Sp1, ແລະໃນລະດັບໜ້ອຍກວ່າການສະແດງອອກຂອງ NFAT.
(ກ) ເມື່ອປຽບທຽບກັບຈຸລັງ T ທີ່ໄດ້ຮັບການเพาะเลี้ยงໂດຍບໍ່ມີ MNA, ການປ່ຽນແປງຄວາມເທົ່າຂອງການສະແດງອອກຂອງ TNFα ໃນຈຸລັງ T ທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ MNA. ຮູບແບບການສະແດງອອກດ້ວຍ SEM ແມ່ນສະແດງໃຫ້ເຫັນ (n = 5 ຜູ້ໃຫ້ທີ່ມີສຸຂະພາບດີ). ສະແດງຂໍ້ມູນຈາກຢ່າງໜ້ອຍ n = 3 ການທົດລອງເອກະລາດ. (ຂ) ໂປຣໂມເຕີ TNFα ຂອງຈຸລັງ T ທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ ຫຼື ບໍ່ມີ 8 mM MNA ຫຼັງຈາກ NFAT ແລະ Sp1 ໄດ້ຖືກລວມເຂົ້າກັບການກະຕຸ້ນ (Ctrl) ແລະ PMA/ionomycin ເປັນເວລາ 4 ຊົ່ວໂມງ. Immunoglobulin G (IgG) ແລະ H3 ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເປັນຕົວຄວບຄຸມທາງລົບ ແລະ ທາງບວກສໍາລັບການຕົກຕະກອນພູມຕ້ານທານຕາມລໍາດັບ. ການວັດແທກປະລິມານຂອງ ChIP ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າການຜູກມັດຂອງ Sp1 ແລະ NFAT ກັບໂປຣໂມເຕີ TNFα ໃນຈຸລັງທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ MNA ເພີ່ມຂຶ້ນຫຼາຍເທົ່າເມື່ອທຽບກັບຕົວຄວບຄຸມ. ສະແດງຂໍ້ມູນຈາກຢ່າງໜ້ອຍ n = 3 ການທົດລອງເອກະລາດ. ຄ່າ P ຖືກກຳນົດໂດຍການທົດສອບ t ຫຼາຍຄັ້ງ (*** P <0.01). (ຄ) ເມື່ອປຽບທຽບກັບນ້ຳໃນທ້ອງຂອງ HGSC, ຈຸລັງ T (ບໍ່ເປັນພິດຕໍ່ຈຸລັງ) ສະແດງໃຫ້ເຫັນການສະແດງອອກຂອງ TNF ທີ່ເພີ່ມຂຶ້ນໃນເນື້ອງອກ. ສີສະແດງເຖິງຄົນເຈັບທີ່ແຕກຕ່າງກັນ. ຈຸລັງທີ່ສະແດງໄດ້ຖືກເກັບຕົວຢ່າງແບບສຸ່ມໄປຫາ 300 ແລະສັ່ນເພື່ອຈຳກັດການດຶງເກີນ (** Padj = 0.0076). (D) ຮູບແບບທີ່ສະເໜີຂອງ MNA ສຳລັບມະເຮັງຮວຍໄຂ່. MNA ຖືກຜະລິດຢູ່ໃນຈຸລັງເນື້ອງອກ ແລະ fibroblast ໃນ TME ແລະຖືກດູດຊຶມໂດຍຈຸລັງ T. MNA ເພີ່ມການຜູກມັດຂອງ Sp1 ກັບໂປຣໂມເຕີ TNFα, ເຊິ່ງນຳໄປສູ່ການຖອດລະຫັດ TNFα ແລະການຜະລິດ cytokine TNFα ທີ່ເພີ່ມຂຶ້ນ. MNA ຍັງເຮັດໃຫ້ IFN-γ ຫຼຸດລົງ. ການຍັບຍັ້ງການເຮັດວຽກຂອງຈຸລັງ T ນຳໄປສູ່ຄວາມສາມາດໃນການຂ້າຫຼຸດລົງ ແລະເລັ່ງການເຕີບໂຕຂອງເນື້ອງອກ.
ອີງຕາມບົດລາຍງານ, TNFα ມີຜົນກະທົບຕໍ່ການຕ້ານເນື້ອງອກ ແລະ ຕ້ານເນື້ອງອກທີ່ຂຶ້ນກັບທາງໜ້າ ແລະ ທາງຫຼັງ, ແຕ່ມັນມີບົດບາດທີ່ຮູ້ຈັກກັນດີໃນການສົ່ງເສີມການເຕີບໂຕ ແລະ ການແຜ່ກະຈາຍຂອງມະເຮັງຮວຍໄຂ່ (31-33). ອີງຕາມບົດລາຍງານ, ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ TNFα ໃນນ້ຳໃນທ້ອງ ແລະ ເນື້ອເຍື່ອເນື້ອງອກໃນຄົນເຈັບທີ່ເປັນມະເຮັງຮວຍໄຂ່ສູງກວ່າໃນເນື້ອເຍື່ອທີ່ບໍ່ເປັນອັນຕະລາຍ (34-36). ໃນດ້ານກົນໄກ, TNFα ສາມາດຄວບຄຸມການກະຕຸ້ນ, ໜ້າທີ່ ແລະ ການຂະຫຍາຍຕົວຂອງເມັດເລືອດຂາວ, ແລະ ປ່ຽນຮູບແບບຂອງຈຸລັງມະເຮັງ (37, 38). ສອດຄ່ອງກັບການຄົ້ນພົບເຫຼົ່ານີ້, ການວິເຄາະການສະແດງອອກຂອງ gene ທີ່ແຕກຕ່າງກັນສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ TNF ໄດ້ຖືກຄວບຄຸມເພີ່ມຂຶ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນຈຸລັງ T ໃນເນື້ອເຍື່ອເນື້ອງອກເມື່ອທຽບກັບນ້ຳໃນທ້ອງ (ຮູບທີ 5C). ການເພີ່ມຂຶ້ນຂອງການສະແດງອອກຂອງ TNF ແມ່ນເຫັນໄດ້ຊັດເຈນພຽງແຕ່ໃນປະຊາກອນຈຸລັງ T ທີ່ມີຮູບແບບທີ່ບໍ່ແມ່ນ cytotoxic (ຮູບ S5A). ໂດຍສະຫຼຸບແລ້ວ, ຂໍ້ມູນເຫຼົ່ານີ້ສະໜັບສະໜູນທັດສະນະທີ່ວ່າ MNA ມີຜົນກະທົບຕໍ່ການຍັບຍັ້ງພູມຕ້ານທານ ແລະ ການສົ່ງເສີມເນື້ອງອກໃນ HGSC.
ການຕິດສະຫຼາກທີ່ມີແສງໄຟເຍືອງແສງໂດຍອີງໃສ່ການໄຫຼວຽນຂອງໄຊໂຕເມຕຣີໄດ້ກາຍເປັນວິທີການຫຼັກສຳລັບການສຶກສາການເຜົາຜານອາຫານຂອງ TIL. ການສຶກສາເຫຼົ່ານີ້ໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າເມື່ອປຽບທຽບກັບລິມໂຟໄຊຕ໌ໃນເລືອດ ຫຼື ຈຸລັງ T ຈາກອະໄວຍະວະລິມໂຟໄຊຕ໌ຂັ້ນສອງ, ໜູ ແລະ TIL ຂອງມະນຸດມີແນວໂນ້ມທີ່ຈະດູດຊຶມນ້ຳຕານໃນເລືອດສູງກວ່າ (4, 39) ແລະ ການສູນເສຍໜ້າທີ່ຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍເທື່ອລະກ້າວ (19, 40). ເຖິງແມ່ນວ່າພວກເຮົາໄດ້ສັງເກດເຫັນຜົນໄດ້ຮັບທີ່ຄ້າຍຄືກັນໃນການສຶກສານີ້, ການພັດທະນາທີ່ສຳຄັນແມ່ນການປຽບທຽບການເຜົາຜານອາຫານຂອງຈຸລັງເນື້ອງອກ ແລະ TIL ຈາກເນື້ອເຍື່ອເນື້ອງອກທີ່ຖືກຕັດອອກຄືກັນ. ສອດຄ່ອງກັບບົດລາຍງານກ່ອນໜ້ານີ້ບາງອັນ, ຈຸລັງເນື້ອງອກ (CD45-EpCAM +) ຈາກນ້ຳໃນທ້ອງ ແລະ ເນື້ອງອກມີການດູດຊຶມນ້ຳຕານໃນເລືອດສູງກວ່າຈຸລັງ CD8 + ແລະ CD4 + T, ເຊິ່ງສະໜັບສະໜູນວ່າການດູດຊຶມນ້ຳຕານໃນເລືອດສູງຂອງຈຸລັງເນື້ອງອກສາມາດປຽບທຽບກັບຈຸລັງ T. ແນວຄວາມຄິດຂອງການແຂ່ງຂັນຂອງຈຸລັງ T. TME. ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ກິດຈະກຳໄມໂທຄອນເດຣຍຂອງຈຸລັງເນື້ອງອກສູງກວ່າຈຸລັງ CD8 + T, ແຕ່ກິດຈະກຳໄມໂທຄອນເດຣຍແມ່ນຄ້າຍຄືກັນກັບຈຸລັງ CD4 + T. ຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້ຢືນຢັນຫົວຂໍ້ທີ່ເກີດຂຶ້ນໃໝ່ວ່າການເຜົາຜານອາຫານແບບຜຸພັງແມ່ນມີຄວາມສຳຄັນສຳລັບຈຸລັງເນື້ອງອກ (41, 42). ພວກເຂົາຍັງແນະນຳວ່າຈຸລັງ CD8 + T ອາດຈະມີຄວາມສ່ຽງຕໍ່ການເຮັດວຽກຜິດປົກກະຕິຂອງອົກຊີເດຊັນຫຼາຍກວ່າຈຸລັງ CD4 + T, ຫຼືວ່າຈຸລັງ CD4 + T ອາດຈະໃຊ້ແຫຼ່ງຄາບອນອື່ນນອກຈາກນ້ຳຕານກລູໂຄສເພື່ອຮັກສາກິດຈະກຳຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍ (43, 44). ຄວນສັງເກດວ່າພວກເຮົາບໍ່ສັງເກດເຫັນຄວາມແຕກຕ່າງໃນການດູດຊຶມນ້ຳຕານກລູໂຄສ ຫຼື ກິດຈະກຳຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍລະຫວ່າງຕົວກະຕຸ້ນ CD4 + T, ໜ່ວຍຄວາມຈຳ T effector ແລະ ຈຸລັງໜ່ວຍຄວາມຈຳສູນກາງ T ໃນນ້ຳໃນທ້ອງ. ເຊັ່ນດຽວກັນ, ສະຖານະການແຕກຕ່າງຂອງຈຸລັງ CD8 + T ໃນເນື້ອງອກບໍ່ມີຫຍັງກ່ຽວຂ້ອງກັບການປ່ຽນແປງໃນການດູດຊຶມນ້ຳຕານກລູໂຄສ, ໂດຍເນັ້ນໃຫ້ເຫັນຄວາມແຕກຕ່າງທີ່ສຳຄັນລະຫວ່າງຈຸລັງ T ທີ່ປູກໃນຫຼອດທົດລອງ ແລະ ຈຸລັງ TIL ຂອງມະນຸດໃນຮ່າງກາຍ (22). ການສັງເກດເຫຼົ່ານີ້ຍັງໄດ້ຮັບການຢືນຢັນໂດຍການນຳໃຊ້ການຈັດສັນປະຊາກອນຈຸລັງອັດຕະໂນມັດທີ່ບໍ່ລຳອຽງ, ເຊິ່ງເປີດເຜີຍຕື່ມອີກວ່າຈຸລັງ CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + ທີ່ມີການດູດຊຶມນ້ຳຕານກລູໂຄສ ແລະ ກິດຈະກຳຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍສູງກວ່າຈຸລັງເນື້ອງອກແມ່ນມີຢູ່ຫຼາຍແຕ່ມີປະຊາກອນຈຸລັງທີ່ມີການເຄື່ອນໄຫວທາງເມຕາໂບລິກ. ປະຊາກອນນີ້ອາດຈະເປັນຕົວແທນຂອງປະຊາກອນຍ່ອຍທີ່ສົມມຸດຕິຖານຂອງຈຸລັງສະກັດກັ້ນ myeloid ຫຼື ຈຸລັງ dendritic plasmacytoid ທີ່ລະບຸໄວ້ໃນການວິເຄາະ scRNA-seq. ເຖິງແມ່ນວ່າທັງສອງຢ່າງນີ້ໄດ້ຖືກລາຍງານໃນເນື້ອງອກຮວຍໄຂ່ຂອງມະນຸດ [45], ແຕ່ພວກມັນຍັງຕ້ອງການວຽກງານຕື່ມອີກຄືການອະທິບາຍກຸ່ມຍ່ອຍ myeloid ນີ້.
ເຖິງແມ່ນວ່າວິທີການທີ່ອີງໃສ່ flow cytometry ສາມາດຊີ້ແຈງຄວາມແຕກຕ່າງທົ່ວໄປໃນການເຜົາຜານນ້ຳຕານກລູໂຄສ ແລະ ການເຜົາຜານອົກຊີເດຊັນລະຫວ່າງຊະນິດຂອງເຊວ, ແຕ່ສານເມຕາໂບໄລທ໌ທີ່ແນ່ນອນທີ່ຜະລິດໂດຍນ້ຳຕານກລູໂຄສ ຫຼື ແຫຼ່ງຄາບອນອື່ນໆສຳລັບການເຜົາຜານໄມໂທຄອນເດຣຍໃນ TME ຍັງບໍ່ທັນໄດ້ກຳນົດເທື່ອ. ການກຳນົດການມີ ຫຼື ບໍ່ມີສານເມຕາໂບໄລທ໌ໃຫ້ກັບກຸ່ມຍ່ອຍ TIL ທີ່ກຳນົດໃຫ້ຕ້ອງການການກັ່ນຕອງປະຊາກອນເຊວຈາກເນື້ອເຍື່ອທີ່ຖືກຕັດອອກ. ດັ່ງນັ້ນ, ວິທີການເສີມເຊວຂອງພວກເຮົາລວມກັບ mass spectrometry ສາມາດໃຫ້ຄວາມເຂົ້າໃຈກ່ຽວກັບສານເມຕາໂບໄລທ໌ທີ່ມີຄວາມອຸດົມສົມບູນແຕກຕ່າງກັນໃນເຊວ T ແລະ ປະຊາກອນເຊວເນື້ອງອກໃນຕົວຢ່າງຄົນເຈັບທີ່ກົງກັນ. ເຖິງແມ່ນວ່າວິທີການນີ້ມີຂໍ້ໄດ້ປຽບຫຼາຍກວ່າການຈັດຮຽງເຊວທີ່ມີການເຍືອງແສງ, ແຕ່ຫ້ອງສະໝຸດສານເມຕາໂບໄລທ໌ບາງຢ່າງອາດຈະໄດ້ຮັບຜົນກະທົບຍ້ອນຄວາມໝັ້ນຄົງໂດຍທຳມະຊາດ ແລະ/ຫຼື ອັດຕາການປ່ຽນຖ່າຍໄວ (22). ເຖິງຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ວິທີການຂອງພວກເຮົາສາມາດລະບຸສານເມຕາໂບໄລທ໌ທີ່ສະກັດກັ້ນພູມຕ້ານທານສອງຊະນິດທີ່ໄດ້ຮັບການຍອມຮັບ, adenosine ແລະ kynurenine, ເພາະວ່າພວກມັນແຕກຕ່າງກັນຫຼາຍລະຫວ່າງປະເພດຕົວຢ່າງ.
ການວິເຄາະດ້ານເມຕາໂບໂນມິກຂອງພວກເຮົາກ່ຽວກັບເນື້ອງອກ ແລະ ຊະນິດຍ່ອຍຂອງ TIL ໃຫ້ຄວາມເຂົ້າໃຈເພີ່ມເຕີມກ່ຽວກັບບົດບາດຂອງສານເມຕາໂບໄລໃນ TME ຂອງຮວຍໄຂ່. ທຳອິດ, ໂດຍການໃຊ້ flow cytometry, ພວກເຮົາໄດ້ກຳນົດວ່າບໍ່ມີຄວາມແຕກຕ່າງໃນກິດຈະກຳຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍລະຫວ່າງເນື້ອງອກ ແລະ ຈຸລັງ CD4 + T. ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ການວິເຄາະ LC-MS/MS ໄດ້ເປີດເຜີຍການປ່ຽນແປງທີ່ສຳຄັນໃນຄວາມອຸດົມສົມບູນຂອງສານເມຕາໂບໄລໃນບັນດາປະຊາກອນເຫຼົ່ານີ້, ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າບົດສະຫຼຸບກ່ຽວກັບການເຜົາຜານ TIL ແລະ ກິດຈະກຳການເຜົາຜານໂດຍລວມຂອງມັນຕ້ອງການການຕີຄວາມຢ່າງລະມັດລະວັງ. ອັນທີສອງ, MNA ແມ່ນສານເມຕາໂບໄລທີ່ມີຄວາມແຕກຕ່າງຫຼາຍທີ່ສຸດລະຫວ່າງຈຸລັງ CD45 ແລະ ຈຸລັງ T ໃນນ້ຳໃນທ້ອງ, ບໍ່ແມ່ນເນື້ອງອກ. ດັ່ງນັ້ນ, ການແບ່ງສ່ວນ ແລະ ຕຳແໜ່ງຂອງເນື້ອງອກອາດມີຜົນກະທົບທີ່ແຕກຕ່າງກັນຕໍ່ການເຜົາຜານ TIL, ເຊິ່ງເນັ້ນໃຫ້ເຫັນເຖິງຄວາມແຕກຕ່າງທີ່ເປັນໄປໄດ້ໃນສະພາບແວດລ້ອມຈຸລະພາກທີ່ກຳນົດ. ອັນທີສາມ, ການສະແດງອອກຂອງເອນໄຊມ໌ທີ່ຜະລິດ MNA NNMT ສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນຈຳກັດຢູ່ໃນ CAF, ເຊິ່ງເປັນຈຸລັງເນື້ອງອກໃນລະດັບທີ່ໜ້ອຍກວ່າ, ແຕ່ລະດັບ MNA ທີ່ສາມາດກວດພົບໄດ້ແມ່ນສັງເກດເຫັນໃນຈຸລັງ T ທີ່ໄດ້ມາຈາກເນື້ອງອກ. ການສະແດງອອກຫຼາຍເກີນໄປຂອງ NNMT ໃນ CAF ຂອງຮວຍໄຂ່ມີຜົນກະທົບທີ່ສົ່ງເສີມມະເຮັງທີ່ຮູ້ຈັກ, ສ່ວນໜຶ່ງແມ່ນຍ້ອນການສົ່ງເສີມການເຜົາຜານ CAF, ການບຸກລຸກຂອງເນື້ອງອກ ແລະ ການແຜ່ກະຈາຍ (27). ເຖິງແມ່ນວ່າລະດັບໂດຍລວມຂອງ TIL ແມ່ນປານກາງ, ການສະແດງອອກຂອງ NNMT ໃນ CAF ແມ່ນກ່ຽວຂ້ອງຢ່າງໃກ້ຊິດກັບຊະນິດ mesenchymal ຂອງ Cancer Genome Atlas (TCGA), ເຊິ່ງກ່ຽວຂ້ອງກັບການພະຍາກອນທີ່ບໍ່ດີ (27, 46, 47). ສຸດທ້າຍ, ການສະແດງອອກຂອງ enzyme AOX1 ທີ່ຮັບຜິດຊອບຕໍ່ການເສື່ອມສະພາບຂອງ MNA ຍັງຖືກຈຳກັດຢູ່ໃນກຸ່ມ CAF, ເຊິ່ງຊີ້ບອກວ່າຈຸລັງ T ຂາດຄວາມສາມາດໃນການເຜົາຜານ MNA. ຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້ສະໜັບສະໜູນແນວຄວາມຄິດທີ່ວ່າເຖິງແມ່ນວ່າຕ້ອງການວຽກງານຕື່ມອີກເພື່ອກວດສອບການຄົ້ນພົບນີ້, ລະດັບສູງຂອງ MNA ໃນຈຸລັງ T ອາດຈະຊີ້ບອກເຖິງການມີຢູ່ຂອງສະພາບແວດລ້ອມຈຸລະພາກ CAF ທີ່ສະກັດກັ້ນພູມຕ້ານທານ.
ເນື່ອງຈາກລະດັບການສະແດງອອກທີ່ຕໍ່າຂອງຕົວຂົນສົ່ງ MNA ແລະລະດັບທີ່ບໍ່ສາມາດກວດພົບໄດ້ຂອງໂປຣຕີນທີ່ສຳຄັນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບການເຜົາຜານ MNA, ການມີ MNA ໃນຈຸລັງ T ແມ່ນເລື່ອງທີ່ບໍ່ຄາດຄິດ. ທັງ NNMT ແລະ AOX1 ບໍ່ສາມາດກວດພົບໄດ້ໂດຍການວິເຄາະ scRNA-seq ແລະ qPCR ເປົ້າໝາຍຂອງສອງກຸ່ມທີ່ເປັນເອກະລາດ. ຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າ MNA ບໍ່ໄດ້ຖືກສັງເຄາະໂດຍຈຸລັງ T, ແຕ່ຖືກດູດຊຶມຈາກ TME ອ້ອມຂ້າງ. ການທົດລອງໃນຫຼອດທົດລອງສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າຈຸລັງ T ມັກຈະສະສົມ MNA ຈາກພາຍນອກ.
ການສຶກສາໃນຫຼອດທົດລອງຂອງພວກເຮົາໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ MNA ຈາກພາຍນອກກະຕຸ້ນການສະແດງອອກຂອງ TNFα ໃນຈຸລັງ T ແລະເສີມຂະຫຍາຍການຜູກມັດຂອງ Sp1 ກັບໂປຣໂມເຕີ TNFα. ເຖິງແມ່ນວ່າ TNFα ມີທັງໜ້າທີ່ຕ້ານເນື້ອງອກ ແລະ ຕ້ານເນື້ອງອກ, ໃນມະເຮັງຮວຍໄຂ່, TNFα ສາມາດສົ່ງເສີມການເຕີບໂຕຂອງມະເຮັງຮວຍໄຂ່ (31-33). ການເຮັດໃຫ້ TNFα ເປັນກາງໃນການເພາະເລี้ยงຈຸລັງເນື້ອງອກຮວຍໄຂ່ ຫຼື ການກຳຈັດສັນຍານ TNFα ໃນແບບຈຳລອງໜູສາມາດປັບປຸງການຜະລິດ cytokine ອັກເສບທີ່ໄກ່ເກ່ຍໂດຍ TNFα ແລະຍັບຍັ້ງການເຕີບໂຕຂອງເນື້ອງອກ (32, 35). ດັ່ງນັ້ນ, ໃນກໍລະນີນີ້, MNA ທີ່ມາຈາກ TME ສາມາດເຮັດໜ້າທີ່ເປັນ metabolite ທີ່ກະຕຸ້ນການອັກເສບຜ່ານກົນໄກທີ່ຂຶ້ນກັບ TNFα ຜ່ານວົງ autocrine, ດັ່ງນັ້ນຈຶ່ງສົ່ງເສີມການເກີດຂຶ້ນ ແລະ ການແຜ່ກະຈາຍຂອງມະເຮັງຮວຍໄຂ່ (31). ໂດຍອີງໃສ່ຄວາມເປັນໄປໄດ້ນີ້, ການສະກັດກັ້ນ TNFα ກຳລັງຖືກສຶກສາເປັນຕົວແທນການປິ່ນປົວທີ່ມີທ່າແຮງສຳລັບມະເຮັງຮວຍໄຂ່ (37, 48, 49). ນອກຈາກນັ້ນ, MNA ຍັງເຮັດໃຫ້ຄວາມເປັນພິດຂອງຈຸລັງ CAR-T ຕໍ່ກັບຈຸລັງເນື້ອງອກຮວຍໄຂ່ຫຼຸດລົງ, ເຊິ່ງສະໜອງຫຼັກຖານເພີ່ມເຕີມສຳລັບການສະກັດກັ້ນພູມຕ້ານທານທີ່ໄກ່ເກ່ຍໂດຍ MNA. ໂດຍລວມແລ້ວ, ຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນຮູບແບບທີ່ເນື້ອງອກ ແລະ ຈຸລັງ CAF ປ່ອຍ MNA ເຂົ້າໄປໃນ TME ນອກຈຸລັງ. ຜ່ານ (i) ການກະຕຸ້ນການເຕີບໂຕຂອງມະເຮັງຮວຍໄຂ່ທີ່ເກີດຈາກ TNF ແລະ (ii) ການຍັບຍັ້ງກິດຈະກຳທີ່ເປັນພິດຕໍ່ຈຸລັງ T ທີ່ເກີດຈາກ MNA, ສິ່ງນີ້ອາດຈະມີຜົນກະທົບຕໍ່ເນື້ອງອກສອງຢ່າງ (ຮູບທີ 5D).
ສະຫຼຸບແລ້ວ, ໂດຍການນຳໃຊ້ການປະສົມປະສານຂອງການເສີມສ້າງຈຸລັງຢ່າງໄວວາ, ການຈັດລຳດັບຈຸລັງດຽວ ແລະ ການວິເຄາະການເຜົາຜານອາຫານ, ການສຶກສານີ້ໄດ້ເປີດເຜີຍຄວາມແຕກຕ່າງທາງດ້ານພູມຕ້ານທານຢ່າງຫຼວງຫຼາຍລະຫວ່າງເນື້ອງອກ ແລະ ຈຸລັງນ້ຳໃນທ້ອງໃນຄົນເຈັບ HGSC. ການວິເຄາະທີ່ຄົບຖ້ວນນີ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າມີຄວາມແຕກຕ່າງໃນການດູດຊຶມນ້ຳຕານ ແລະ ກິດຈະກຳຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍລະຫວ່າງຈຸລັງ T, ແລະ ໄດ້ລະບຸ MNA ເປັນສານເຜົາຜານທີ່ຄວບຄຸມພູມຕ້ານທານທີ່ບໍ່ແມ່ນຈຸລັງ. ຂໍ້ມູນເຫຼົ່ານີ້ມີຜົນກະທົບຕໍ່ວິທີທີ່ TME ສົ່ງຜົນກະທົບຕໍ່ການເຜົາຜານຂອງຈຸລັງ T ໃນມະເຮັງຂອງມະນຸດ. ເຖິງແມ່ນວ່າການແຂ່ງຂັນໂດຍກົງສຳລັບສານອາຫານລະຫວ່າງຈຸລັງ T ແລະ ຈຸລັງມະເຮັງໄດ້ຖືກລາຍງານແລ້ວ, ແຕ່ສານເຜົາຜານຍັງສາມາດເຮັດໜ້າທີ່ເປັນຕົວຄວບຄຸມທາງອ້ອມເພື່ອສົ່ງເສີມຄວາມຄືບໜ້າຂອງເນື້ອງອກ ແລະ ອາດຈະສະກັດກັ້ນການຕອບສະໜອງຂອງພູມຕ້ານທານພາຍໃນ. ການອະທິບາຍເພີ່ມເຕີມກ່ຽວກັບບົດບາດໜ້າທີ່ຂອງສານເຜົາຜານທີ່ຄວບຄຸມເຫຼົ່ານີ້ອາດຈະເປີດຍຸດທະສາດທາງເລືອກສຳລັບການເສີມຂະຫຍາຍການຕອບສະໜອງຂອງພູມຕ້ານທານຕ້ານເນື້ອງອກ.
ຕົວຢ່າງ ແລະ ຂໍ້ມູນທາງດ້ານຄລີນິກຂອງຄົນເຈັບໄດ້ຮັບຜ່ານບ່ອນເກັບມ້ຽນເນື້ອເຍື່ອມະເຮັງ BC ທີ່ໄດ້ຮັບການຮັບຮອງຈາກເຄືອຂ່າຍບ່ອນເກັບມ້ຽນເນື້ອເຍື່ອການາດາ. ອີງຕາມໂປໂຕຄອນທີ່ໄດ້ຮັບການອະນຸມັດຈາກຄະນະກຳມະການຈັນຍາບັນການຄົ້ນຄວ້າມະເຮັງ BC ແລະ ມະຫາວິທະຍາໄລ British Columbia (H07-00463), ຕົວຢ່າງ ແລະ ຂໍ້ມູນທາງດ້ານຄລີນິກຂອງຄົນເຈັບທັງໝົດໄດ້ຮັບການຍິນຍອມເປັນລາຍລັກອັກສອນ ຫຼື ຍົກເວັ້ນການຍິນຍອມຢ່າງເປັນທາງການ. ຕົວຢ່າງຖືກເກັບໄວ້ໃນ BioBank ທີ່ໄດ້ຮັບການຮັບຮອງ (BRC-00290). ລາຍລະອຽດຂອງຄົນເຈັບແມ່ນສະແດງຢູ່ໃນຕາຕະລາງ S1 ແລະ S5. ສຳລັບການແຊ່ແຂງ, ມີດຜ່າຕັດເພື່ອຍ່ອຍສະຫຼາຍຕົວຢ່າງເນື້ອງອກຂອງຄົນເຈັບດ້ວຍກົນຈັກ ແລະ ຈາກນັ້ນຍູ້ມັນຜ່ານຕົວກອງຂະໜາດ 100 ໄມຄຣອນເພື່ອໃຫ້ໄດ້ຈຸລັງລະລາຍດຽວ. ນ້ຳໃນທ້ອງຂອງຄົນເຈັບໄດ້ຖືກປั่นແຍກດ້ວຍຄວາມໄວ 1500 rpm ເປັນເວລາ 10 ນາທີ ທີ່ອຸນຫະພູມ 4°C ເພື່ອບີບຈຸລັງ ແລະ ເອົານ້ຳທີ່ໄຫຼອອກມາ. ຈຸລັງທີ່ໄດ້ມາຈາກເນື້ອງອກ ແລະ ນ້ຳໃນທ້ອງໄດ້ຖືກເກັບຮັກສາໄວ້ໃນສະພາບແຊ່ແຂງໃນເຊລັ່ມ AB ຂອງມະນຸດ 50% ທີ່ຖືກເຮັດໃຫ້ບໍ່ມີການເຄື່ອນໄຫວດ້ວຍຄວາມຮ້ອນ (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) ແລະ 10% dimethyl sulfoxide. ສານລະລາຍຈຸລັງດ່ຽວທີ່ຮັກສາໄວ້ເຫຼົ່ານີ້ໄດ້ຖືກລະລາຍ ແລະ ນຳໃຊ້ສຳລັບການກຳນົດເມຕາໂບໂລມິກສ໌ ແລະ ການເຜົາຜານອາຫານທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ຂ້າງລຸ່ມນີ້.
ສື່ກາງທີ່ສົມບູນປະກອບດ້ວຍ RPMI 1640 ທີ່ມີຄວາມໜາ 0.22 μm ກັ່ນຕອງ 50:50 ເສີມດ້ວຍ AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) ເສີມດ້ວຍ serum AB ຂອງມະນຸດທີ່ຖືກທຳລາຍດ້ວຍຄວາມຮ້ອນ 10% (Sigma-Aldrich), 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific), 1 x ສານລະລາຍ Penicillin Streptomycin (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) ແລະ 50 μMB-mercaptoethanol. AimV (Invitrogen) ເສີມດ້ວຍ 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) ແລະ 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific). ບັຟເຟີ້ການຍ້ອມສີດ້ວຍ flow cytometer ປະກອບດ້ວຍນ້ຳເຄັມຟອສເຟດທີ່ກັ່ນຕອງແລ້ວ 0.22μm (PBS; Invitrogen) ທີ່ເສີມດ້ວຍເຊລັ່ມ AB ຂອງມະນຸດທີ່ສະກັດກັ້ນຄວາມຮ້ອນ 3% (Sigma). ບັຟເຟີ້ການເສີມເຊລັ່ມປະກອບດ້ວຍ PBS ທີ່ກັ່ນຕອງແລ້ວ 0.22μm ແລະເສີມດ້ວຍເຊລັ່ມ AB ຂອງມະນຸດທີ່ສະກັດກັ້ນຄວາມຮ້ອນ 0.5% (Sigma-Aldrich).
ໃນສື່ກາງທີ່ສົມບູນ 37°C, ຈຸລັງໄດ້ຖືກຍ້ອມສີດ້ວຍ 10 nM MT DR ແລະ 100 μM 2-NBDG ເປັນເວລາ 30 ນາທີ. ຕໍ່ໄປ, ຈຸລັງໄດ້ຖືກຍ້ອມສີດ້ວຍສີຍ້ອມ eF506 ທີ່ 4°C ເປັນເວລາ 15 ນາທີ. ຍ້ອມຈຸລັງຄືນໃໝ່ໃນ FC Block (eBioscience) ແລະ Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), ເຈືອຈາງໃນບັຟເຟີຍ້ອມສີ flow cytometer (ຕາມຄຳແນະນຳຂອງຜູ້ຜະລິດ), ແລະ ບົ່ມເຊື້ອເປັນເວລາ 10 ນາທີທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງ. ຍ້ອມຈຸລັງດ້ວຍຊຸດຂອງພູມຕ້ານທານ (ຕາຕະລາງ S2) ໃນບັຟເຟີຍ້ອມສີ flow cytometry ທີ່ 4°C ເປັນເວລາ 20 ນາທີ. ຍ້ອມຈຸລັງຄືນໃໝ່ໃນບັຟເຟີຍ້ອມສີ flow cytometry (Cytek Aurora; ການຕັ້ງຄ່າ 3L-16V-14B-8R) ກ່ອນການວິເຄາະ. ໃຊ້ SpectroFlo ແລະ FlowJo V10 ເພື່ອວິເຄາະຂໍ້ມູນຈຳນວນຈຸລັງ, ແລະ ໃຊ້ GraphPad Prism 8 ເພື່ອສ້າງຂໍ້ມູນ. ຄວາມເຂັ້ມແສງສະເລ່ຍ (MFI) ຂອງ 2-NBDG ແລະ MT DR ໄດ້ຖືກປັບໃຫ້ເປັນປົກກະຕິ, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນການທົດສອບ t ທີ່ຈັບຄູ່ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການວິເຄາະທາງສະຖິຕິເພື່ອພິຈາລະນາຄົນເຈັບທີ່ກົງກັນ. ເອົາກຸ່ມປະຊາກອນທັງໝົດທີ່ມີເຫດການໜ້ອຍກວ່າ 40 ອອກຈາກການວິເຄາະ; ໃສ່ຄ່າ MFI ເປັນ 1 ສໍາລັບຄ່າລົບໃດໆກ່ອນທີ່ຈະດໍາເນີນການວິເຄາະທາງສະຖິຕິແລະການສະແດງຂໍ້ມູນ.
ເພື່ອເສີມກົນລະຍຸດການປິດກັ້ນດ້ວຍຕົນເອງຂອງແຜງຂະບວນການຂ້າງເທິງ, ພວກເຮົາໄດ້ໃຊ້ຄຳບັນຍາຍເຕັມຮູບແບບໂດຍຕົ້ນໄມ້ຈຳກັດຮູບຮ່າງ (FAUST) (21) ເພື່ອມອບໝາຍຈຸລັງໃຫ້ກັບປະຊາກອນໂດຍອັດຕະໂນມັດຫຼັງຈາກກຳຈັດຈຸລັງທີ່ຕາຍແລ້ວໃນ FlowJo. ພວກເຮົາຈັດການຜົນຜະລິດດ້ວຍຕົນເອງເພື່ອລວມປະຊາກອນທີ່ເບິ່ງຄືວ່າຖືກຈັດສັນທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງ (ລວມ PD1+ ກັບຈຸລັງເນື້ອງອກ PD1) ແລະປະຊາກອນທີ່ເກັບຮັກສາໄວ້. ແຕ່ລະຕົວຢ່າງມີຈຸລັງສະເລ່ຍຫຼາຍກວ່າ 2%, ສຳລັບປະຊາກອນທັງໝົດ 11 ກຸ່ມ.
ການປั่นແຍກຄວາມໜາແໜ້ນຂອງ Ficoll gradient ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອແຍກ PBMC ອອກຈາກຜະລິດຕະພັນແຍກເມັດເລືອດຂາວ (STEMCELL Technologies). ຈຸລັງ CD8 + T ໄດ້ຖືກແຍກອອກຈາກ PBMC ໂດຍໃຊ້ CD8 MicroBeads (Miltenyi) ແລະຂະຫຍາຍໃນສື່ກາງທີ່ສົມບູນໂດຍໃຊ້ TransAct (Miltenyi) ເປັນເວລາ 2 ອາທິດຕາມຄໍາແນະນໍາຂອງຜູ້ຜະລິດ. ຈຸລັງໄດ້ຖືກປະໄວ້ເປັນເວລາ 5 ມື້ໃນສື່ກາງທີ່ສົມບູນທີ່ມີ IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນກະຕຸ້ນຄືນໃໝ່ດ້ວຍ TransAct. ໃນມື້ທີ 7, ອີງຕາມຄໍາແນະນໍາຂອງຜູ້ຜະລິດ, CD45 MicroBeads ຂອງມະນຸດ (Miltenyi) ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອເສີມສ້າງຈຸລັງໃນສາມຮອບຕິດຕໍ່ກັນ. ຈຸລັງໄດ້ຖືກແບ່ງສ່ວນສໍາລັບການວິເຄາະ flow cytometry (ດັ່ງທີ່ໄດ້ອະທິບາຍຂ້າງເທິງ), ແລະຈຸລັງຫນຶ່ງລ້ານຈຸລັງໄດ້ຖືກແບ່ງສ່ວນສາມຄັ້ງສໍາລັບການວິເຄາະ LC-MS/MS. ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກປະມວນຜົນໂດຍ LC-MS/MS ຕາມທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ຂ້າງລຸ່ມນີ້. ພວກເຮົາໄດ້ປະເມີນຄ່າ metabolite ທີ່ຂາດຫາຍໄປດ້ວຍຈໍານວນໄອອອນ 1,000. ຕົວຢ່າງແຕ່ລະອັນຈະຖືກປັບໃຫ້ເປັນປົກກະຕິໂດຍຈຳນວນໄອອອນທັງໝົດ (TIC), ປ່ຽນເປັນແບບລໍກາຣິດ ແລະ ປັບໃຫ້ເປັນປົກກະຕິໂດຍອັດຕະໂນມັດໃນ MetaboAnalystR ກ່ອນການວິເຄາະ.
ຈຸລັງລະລາຍຈຸລັງດ່ຽວຂອງຄົນເຈັບແຕ່ລະຄົນໄດ້ຖືກລະລາຍ ແລະ ກັ່ນຕອງຜ່ານຕົວກອງ 40 μm ເຂົ້າໄປໃນສື່ກາງທີ່ສົມບູນ (ດັ່ງທີ່ໄດ້ອະທິບາຍຂ້າງເທິງ). ອີງຕາມໂປໂຕຄອນຂອງຜູ້ຜະລິດ, ການຄັດເລືອກໃນທາງບວກສາມຮອບຕິດຕໍ່ກັນໂດຍການແຍກລູກປັດແມ່ເຫຼັກໂດຍໃຊ້ MicroBeads (Miltenyi) ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອເສີມສ້າງຕົວຢ່າງສໍາລັບຈຸລັງ CD8+, CD4+ ແລະ CD45- (ເທິງນ້ໍາກ້ອນ). ສະຫຼຸບແລ້ວ, ຈຸລັງຈະຖືກລະລາຍຄືນໃໝ່ໃນບັຟເຟີເສີມສ້າງຈຸລັງ (ດັ່ງທີ່ໄດ້ອະທິບາຍຂ້າງເທິງ) ແລະ ນັບ. ຈຸລັງໄດ້ຖືກບົ່ມດ້ວຍລູກປັດ CD8 ຂອງມະນຸດ, ລູກປັດ CD4 ຂອງມະນຸດ ຫຼື ລູກປັດ CD45 ຂອງມະນຸດ (Miltenyi) ທີ່ອຸນຫະພູມ 4°C ເປັນເວລາ 15 ນາທີ, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນລ້າງດ້ວຍບັຟເຟີເສີມສ້າງຈຸລັງ. ຕົວຢ່າງຈະຖືກສົ່ງຜ່ານຖັນ LS (Miltenyi), ແລະ ສ່ວນປະກອບບວກ ແລະ ລົບຈະຖືກເກັບກຳ. ເພື່ອຫຼຸດຜ່ອນໄລຍະເວລາ ແລະ ເພີ່ມຂັ້ນຕອນການຟື້ນຟູຈຸລັງໃຫ້ສູງສຸດ, ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ສ່ວນປະກອບ CD8 ຈະຖືກໃຊ້ສໍາລັບຮອບທີສອງຂອງການເສີມສ້າງ CD4+, ແລະ ສ່ວນປະກອບ CD4 ຈະຖືກໃຊ້ສໍາລັບການເສີມສ້າງ CD45 ຕໍ່ມາ. ຮັກສາສານລະລາຍໄວ້ໃນນ້ໍາກ້ອນຕະຫຼອດຂະບວນການແຍກ.
ເພື່ອກະກຽມຕົວຢ່າງສຳລັບການວິເຄາະສານເມທານອນ, ຈຸລັງໄດ້ຖືກລ້າງໜຶ່ງຄັ້ງດ້ວຍສານລະລາຍເກືອເຢັນ, ແລະ ເມທານອນ 80% 1 ມລ ໄດ້ຖືກເພີ່ມໃສ່ແຕ່ລະຕົວຢ່າງ, ຈາກນັ້ນຖືກປັ່ນ ແລະ ແຊ່ແຂງໃນໄນໂຕຣເຈນແຫຼວ. ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກນຳໄປຜ່ານການແຊ່ແຂງ-ລະລາຍສາມຮອບ ແລະ ປั่นແຍກທີ່ 14,000 rpm ເປັນເວລາ 15 ນາທີ ທີ່ອຸນຫະພູມ 4°C. ສານທີ່ຢູ່ເທິງສຸດທີ່ມີສານເມທານອນຈະຖືກລະເຫີຍຈົນກວ່າຈະແຫ້ງ. ສານເມທານອນໄດ້ຖືກລະລາຍຄືນໃໝ່ໃນກົດຟໍມິກ 0.03% 50 μl, ປັ່ນເພື່ອປະສົມ, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນຖືກປั่นແຍກເພື່ອກຳຈັດສິ່ງເສດເຫຼືອ.
ສະກັດສານເມຕາໂບໄລທ໌ຕາມທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ຂ້າງເທິງ. ຍ້າຍນ້ຳທີ່ໄຫຼອອກມາຈາກເຊວໄປໃສ່ຂວດໂຄຣມາໂຕກຣາຟີຂອງແຫຼວປະສິດທິພາບສູງສຳລັບການຄົ້ນຄວ້າກ່ຽວກັບເມຕາໂບໂລມິກ. ໃຊ້ໂປໂຕຄອນການປິ່ນປົວແບບສຸ່ມເພື່ອປິ່ນປົວແຕ່ລະຕົວຢ່າງດ້ວຍຈຳນວນຈຸລັງທີ່ຄ້າຍຄືກັນເພື່ອປ້ອງກັນຜົນກະທົບຂອງການເປັນຊຸດ. ພວກເຮົາໄດ້ດຳເນີນການປະເມີນຄຸນນະພາບຂອງສານເມຕາໂບໄລທ໌ທົ່ວໂລກທີ່ເຄີຍເຜີຍແຜ່ໃນເຄື່ອງວັດແທກມວນສານສາມຫຼ່ຽມສີ່ຊັ້ນ AB SCIEX QTRAP 5500 (50). ການວິເຄາະໂຄຣມາໂຕກຣາຟີ ແລະ ການເຊື່ອມໂຍງພື້ນທີ່ຈຸດສູງສຸດໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ຊອບແວ MultiQuant ເວີຊັນ 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
ການນັບໄອອອນ 1000 ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອປະເມີນຄ່າ metabolite ທີ່ຂາດຫາຍໄປ, ແລະ TIC ຂອງແຕ່ລະຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອຄິດໄລ່ພື້ນທີ່ສູງສຸດທີ່ເປັນປົກກະຕິຂອງ metabolite ແຕ່ລະອັນທີ່ກວດພົບເພື່ອແກ້ໄຂການປ່ຽນແປງທີ່ນໍາສະເໜີໂດຍການວິເຄາະເຄື່ອງມືຈາກການປະມວນຜົນຕົວຢ່າງ. ຫຼັງຈາກ TIC ຖືກເຮັດໃຫ້ເປັນປົກກະຕິ, MetaboAnalystR(51) (ພາລາມິເຕີເລີ່ມຕົ້ນ) ຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການປ່ຽນ logarithmic ແລະການຂະຫຍາຍເສັ້ນ norm ອັດຕະໂນມັດ. ພວກເຮົາໄດ້ໃຊ້ PCA ກັບຊຸດ vegan R ເພື່ອດໍາເນີນການວິເຄາະການສໍາຫຼວດຄວາມແຕກຕ່າງຂອງ metabolome ລະຫວ່າງປະເພດຕົວຢ່າງ, ແລະໃຊ້ການວິເຄາະ redundancy ບາງສ່ວນເພື່ອວິເຄາະຄົນເຈັບ. ໃຊ້ວິທີ Ward ເພື່ອສ້າງ dendrogram ແຜນທີ່ຄວາມຮ້ອນເພື່ອຈັດກຸ່ມໄລຍະຫ່າງ Euclidean ລະຫວ່າງຕົວຢ່າງ. ພວກເຮົາໄດ້ໃຊ້ limma (52) ກ່ຽວກັບຄວາມອຸດົມສົມບູນຂອງ metabolite ມາດຕະຖານເພື່ອກໍານົດ metabolites ທີ່ມີຄວາມອຸດົມສົມບູນແຕກຕ່າງກັນໃນທົ່ວປະເພດຈຸລັງທັງໝົດແລະ microenvironment. ເພື່ອເຮັດໃຫ້ຄໍາອະທິບາຍງ່າຍຂຶ້ນ, ພວກເຮົາໃຊ້ພາລາມິເຕີສະເລ່ຍຂອງກຸ່ມເພື່ອລະບຸຮູບແບບ, ແລະພິຈາລະນາປະເພດຈຸລັງໃນ microenvironment ເປັນແຕ່ລະກຸ່ມ (n = 6 ກຸ່ມ); ສຳລັບການທົດສອບຄວາມສຳຄັນ, ພວກເຮົາໄດ້ປະຕິບັດການວັດແທກຊ້ຳໆສາມຄັ້ງສຳລັບແຕ່ລະ metabolite. ເພື່ອຫຼີກເວັ້ນການຊ້ຳຊ້ອນທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງ, ຄົນເຈັບໄດ້ຖືກລວມເຂົ້າເປັນອຸປະສັກໃນການອອກແບບ limma. ເພື່ອກວດສອບຄວາມແຕກຕ່າງຂອງ metabolites ລະຫວ່າງຄົນເຈັບທີ່ແຕກຕ່າງກັນ, ພວກເຮົາໄດ້ປັບຮູບແບບ limma ລວມທັງຄົນເຈັບໃນລັກສະນະທີ່ຄົງທີ່. ພວກເຮົາລາຍງານຄວາມສຳຄັນຂອງຄວາມແຕກຕ່າງທີ່ລະບຸໄວ້ລ່ວງໜ້າລະຫວ່າງປະເພດຂອງເຊວ ແລະ ສະພາບແວດລ້ອມຈຸລະພາກຂອງ Padj <0.05 (ການແກ້ໄຂ Benjamini-Hochberg).
ຫຼັງຈາກການເສີມສ້າງຄວາມເຂັ້ມແຂງໂດຍໃຊ້ຊຸດກຳຈັດເຊວຕາຍ Miltenyi (ມີຊີວິດລອດ >80%), ການຈັດລຳດັບ transcriptome ຈຸລັງດຽວໄດ້ຖືກປະຕິບັດໃນນ້ຳໃນຊ່ອງທ້ອງແຊ່ແຂງ ແລະ ຕົວຢ່າງເນື້ອງອກທັງໝົດທີ່ໃຊ້ຊີວິດໂດຍໃຊ້ໂປໂຕຄອນການສະແດງອອກຂອງ gene 10x 5′. ຫ້າກໍລະນີທີ່ມີເນື້ອງອກ ແລະ ນ້ຳໃນຊ່ອງທ້ອງທີ່ກົງກັນໄດ້ຖືກວິເຄາະ, ເຖິງແມ່ນວ່າຄວາມມີຊີວິດລອດຕໍ່າຈາກຕົວຢ່າງເນື້ອງອກໜຶ່ງອັນໄດ້ປ້ອງກັນບໍ່ໃຫ້ມັນລວມເຂົ້າ. ເພື່ອໃຫ້ບັນລຸການເລືອກຄົນເຈັບຫຼາຍຄັ້ງ, ພວກເຮົາໄດ້ລວມຕົວຢ່າງຂອງຄົນເຈັບແຕ່ລະຄົນໃນຊ່ອງທາງຂອງຕົວຄວບຄຸມ chromium 10x, ແລະວິເຄາະນ້ຳໃນຊ່ອງທ້ອງ ແລະ ສະຖານທີ່ເນື້ອງອກແຍກຕ່າງຫາກ. ຫຼັງຈາກການຈັດລຳດັບ [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), genome Quebec; ໂດຍສະເລ່ຍ 73,488 ແລະ 41,378 ການອ່ານຕໍ່ຈຸລັງສຳລັບເນື້ອງອກ ແລະ ນ້ຳໃນຊ່ອງທ້ອງຕາມລຳດັບ]], ພວກເຮົາໄດ້ໃຊ້ CellSNP ແລະ Vireo (53) (ອີງຕາມ CellSNP ເປັນ SNP ຂອງມະນຸດທົ່ວໄປ (VCF) ທີ່ສະໜອງໃຫ້ໂດຍ GRCh38 ແມ່ນໄດ້ກຳນົດຕົວຕົນຂອງຜູ້ໃຫ້. ພວກເຮົາໃຊ້ SNPRelate ເພື່ອອະນຸມານຕົວຕົນທີ່ໃກ້ທີ່ສຸດ (IBS) ຂອງສະຖານະພາບ genotype (IBS) ຂອງຄົນເຈັບ, ບໍ່ລວມເອົາຈຸລັງທີ່ບໍ່ໄດ້ຮັບການກຳນົດ ແລະ ຈຸລັງທີ່ລະບຸວ່າເປັນ duplexes ແລະ ຜູ້ໃຫ້ທີ່ກົງກັນລະຫວ່າງຕົວຢ່າງນ້ຳໃນຊ່ອງທ້ອງ ແລະ ເນື້ອງອກ (54). ໂດຍອີງໃສ່ໜ້າວຽກນີ້, ພວກເຮົາເກັບຮັກສາສາມກໍລະນີທີ່ມີຕົວແທນຈຸລັງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນເນື້ອງອກ ແລະ ນ້ຳໃນຊ່ອງທ້ອງສຳລັບການວິເຄາະລຸ່ມນ້ຳ. ຫຼັງຈາກປະຕິບັດຂັ້ນຕອນການກັ່ນຕອງມວນສານໃນການຫຸ້ມຫໍ່ BioConductor ຂອງ scater (55) ແລະ scran (56), ສິ່ງນີ້ໃຫ້ຜົນຜະລິດຈຸລັງ 6975 ຈຸລັງ (2792 ແລະ 4183 ຈຸລັງຈາກເນື້ອງອກ ແລະ ນ້ຳໃນຊ່ອງທ້ອງຕາມລຳດັບ) ສຳລັບການວິເຄາະ. ພວກເຮົາໃຊ້ການຈັດກຸ່ມ Louvain ຂອງ igraph (57) ຂອງເຄືອຂ່າຍເພື່ອນບ້ານທີ່ໃກ້ທີ່ສຸດທີ່ໃຊ້ຮ່ວມກັນ (SNN) ໂດຍອີງໃສ່ Jaccard ໄລຍະຫ່າງໄປຫາຈຸລັງກຸ່ມໂດຍການສະແດງອອກ. ກຸ່ມດັ່ງກ່າວໄດ້ຖືກໝາຍດ້ວຍມືໃສ່ປະເພດຈຸລັງທີ່ສົມມຸດຕິຖານໂດຍອີງໃສ່ການສະແດງອອກຂອງ gene marker ແລະເບິ່ງເຫັນດ້ວຍ t-SNE. ຈຸລັງ T cytotoxic ຖືກກຳນົດໂດຍການສະແດງອອກຂອງ CD8A ແລະ GZMA, ບໍ່ລວມເອົາກຸ່ມຍ່ອຍທີ່ມີການສະແດງອອກຂອງໂປຣຕີນ ribosomal ຕ່ຳ. ພວກເຮົາໄດ້ເຂົ້າເຖິງຂໍ້ມູນທີ່ເຜີຍແຜ່ຂອງ Izar et al. (16), ລວມທັງການຝັງ t-SNE ຂອງພວກມັນ, ສາມາດຄວບຄຸມການສະແດງອອກທີ່ຊ້ອນກັນລະຫວ່າງເຄື່ອງໝາຍຈຸລັງພູມຕ້ານທານ ແລະ ການສະແດງອອກ NNMT.
PBMC ໄດ້ຖືກແຍກອອກຈາກຜະລິດຕະພັນການແຍກເມັດເລືອດຂາວ (STEMCELL Technologies) ໂດຍການປั่นແຍກຄວາມໜາແໜ້ນຂອງ Ficoll gradient. ຈຸລັງ CD3 + ໄດ້ຖືກແຍກອອກຈາກ PBMC ໂດຍໃຊ້ລູກປັດ CD3 (Miltenyi). ໃນເວລາທີ່ມີ ຫຼື ບໍ່ມີ MNA, ຈຸລັງ CD3+ ໄດ້ຖືກກະຕຸ້ນດ້ວຍ CD3 ທີ່ຜູກມັດແຜ່ນ (5μg/ml), CD28 ທີ່ລະລາຍໄດ້ (3μg/ml) ແລະ IL-2 (300 U/ml; Proleukin). ໃນມື້ສຸດທ້າຍຂອງການຂະຫຍາຍຕົວ, ຄວາມຢູ່ລອດ (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) ແລະ ການຂະຫຍາຍຕົວ (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) ໄດ້ຖືກປະເມີນໂດຍ flow cytometry. ປະເມີນການເຮັດວຽກຂອງ effector ໂດຍການກະຕຸ້ນຈຸລັງດ້ວຍ PMA (20 ng/ml) ແລະ ionomycin (1μg/ml) ດ້ວຍ GolgiStop ເປັນເວລາ 4 ຊົ່ວໂມງ, ແລະ ຕິດຕາມ CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) ແລະ TNFα-fluorescein isothiocyanate (FITC) (MAb11, BD). ກະຕຸ້ນຈຸລັງ qPCR ແລະ ChIP ດ້ວຍ PMA (20 ng/ml) ແລະ ionomycin (1μg/ml) ເປັນເວລາ 4 ຊົ່ວໂມງ. ສານ ELISA supernatant ໄດ້ຖືກເກັບກ່ອນ ແລະ ຫຼັງການກະຕຸ້ນດ້ວຍ PMA (20 ng/ml) ແລະ ionomycin (1 μg/ml) ເປັນເວລາ 4 ຊົ່ວໂມງ.
ປະຕິບັດຕາມໂປໂຕຄອນຂອງຜູ້ຜະລິດເພື່ອແຍກ RNA ໂດຍໃຊ້ RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). ໃຊ້ QIAshredder (QIAGEN) ເພື່ອເຮັດໃຫ້ຕົວຢ່າງເປັນເອກະພາບ. ໃຊ້ຊຸດ RNA ກັບ cDNA ທີ່ມີຄວາມສາມາດສູງ (Thermo Fisher Scientific) ເພື່ອສັງເຄາະ DNA ເສີມ (cDNA). ໃຊ້ TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) ເພື່ອວັດແທກການສະແດງອອກຂອງ gene (ອີງຕາມໂປໂຕຄອນຂອງຜູ້ຜະລິດ) ດ້ວຍໂພຣບຕໍ່ໄປນີ້: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [glyceraldehyde-3-phosphate off Hydrogen (GAPDH)] ແລະ Hs01010726_m1 (SLC22A2). ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກນຳໃຊ້ໃນລະບົບ PCR ແບບເວລາຈິງ StepOnePlus (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) ໃນແຜ່ນປະຕິກິລິຍາ 96 ຫຼຸມ MicroAmp ທີ່ມີແສງໄວ (Applied Biosystems) ພ້ອມດ້ວຍຟິມແສງ MicroAmp. ຄ່າ Ct ໃດໆທີ່ເກີນ 35 ຖືວ່າຢູ່ເໜືອຂອບເຂດການກວດຈັບ ແລະ ຖືກໝາຍວ່າບໍ່ສາມາດກວດພົບໄດ້.
ປະຕິບັດ ChIP ຕາມທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ກ່ອນໜ້ານີ້ (58). ສະຫຼຸບແລ້ວ, ຈຸລັງໄດ້ຮັບການປະຕິບັດດ້ວຍ formaldehyde (ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນສຸດທ້າຍ 1.42%) ແລະ ບົ່ມເຊື້ອຢູ່ທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງເປັນເວລາ 10 ນາທີ. ໃຊ້ສານເຕີມແຕ່ງ swelling buffer (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl ແລະ 0.1% NP-40) ໃສ່ນ້ຳກ້ອນເປັນເວລາ 10 ນາທີ, ຈາກນັ້ນລະລາຍຄືນໃໝ່ໃນສານ immunoprecipitation buffer ຕາມທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ (58). ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກ sonicated ດ້ວຍຮອບວຽນຕໍ່ໄປນີ້: 10 ຮອບ (20 pulses 1 ວິນາທີ) ແລະ ເວລາຄົງທີ່ 40 ວິນາທີ. ບົ່ມເຊື້ອ immunoglobulin G ລະດັບ ChIP (Cell Signaling Technology; 1μl), histone H3 (Cell Signaling Technology; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) ແລະ SP1 (Cell Signaling Technology; 3μl) antibodies ດ້ວຍຕົວຢ່າງທີ່ອຸນຫະພູມ 4°CC ສັ່ນຄ້າງຄືນ. ບົ່ມເມັດໂປຣຕີນ A (Thermo Fisher Scientific) ດ້ວຍຕົວຢ່າງທີ່ອຸນຫະພູມ 4°C ດ້ວຍການສັ່ນເບົາໆເປັນເວລາ 1 ຊົ່ວໂມງ, ຈາກນັ້ນໃຊ້ເມັດ chelex (Bio-Rad) ເພື່ອເສີມ DNA, ແລະ ໃຊ້ proteinase K (Thermo Fisher) ສຳລັບການຍ່ອຍໂປຣຕີນ. ໂປຣໂມເຕີ TNFα ຖືກກວດພົບໂດຍ PCR: forward, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (ຜະລິດຕະພັນ 207-bp). ຮູບພາບໄດ້ຖືກຜະລິດໂດຍ Image Lab (Bio-Rad) ແລະ ວັດແທກປະລິມານໂດຍໃຊ້ຊອບແວ ImageJ.
ນ້ຳຍ່ຽວທີ່ໄຫຼອອກມາຈາກການເພາະເລี้ยงຈຸລັງໄດ້ຖືກເກັບກຳຕາມທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ຂ້າງເທິງ. ການກຳນົດໄດ້ດຳເນີນໄປຕາມຂັ້ນຕອນຂອງຜູ້ຜະລິດຂອງຊຸດ TNFα ELISA ຂອງມະນຸດ (Invitrogen), ຊຸດ IL-2 ELISA ຂອງມະນຸດ (Invitrogen) ແລະ ຊຸດ IFN-γ ELISA ຂອງມະນຸດ (Abcam). ອີງຕາມໂປໂຕຄອນຂອງຜູ້ຜະລິດ, ນ້ຳຍ່ຽວທີ່ຖືກລະລາຍໃນອັດຕາສ່ວນ 1:100 ເພື່ອກວດຫາ TNFα ແລະ IL-2, ແລະ 1:3 ເພື່ອກວດຫາ IFN-γ. ໃຊ້ເຄື່ອງອ່ານປ້າຍຫຼາຍປ້າຍ EnVision 2104 (PerkinElmer) ເພື່ອວັດແທກການດູດຊຶມທີ່ 450 nm.
PBMC ໄດ້ຖືກແຍກອອກຈາກຜະລິດຕະພັນແຍກເມັດເລືອດຂາວ (STEMCELL Technologies) ໂດຍການປั่นແຍກຄວາມໜາແໜ້ນຂອງ Ficoll gradient. ຈຸລັງ CD3 + ໄດ້ຖືກແຍກອອກຈາກ PBMC ໂດຍໃຊ້ລູກປັດ CD3 (Miltenyi). ໃນເວລາທີ່ມີ ຫຼື ບໍ່ມີ MNA, ຈຸລັງ CD3+ ໄດ້ຖືກກະຕຸ້ນດ້ວຍ CD3 ທີ່ຜູກມັດດ້ວຍແຜ່ນ (5μg/ml), CD28 ທີ່ລະລາຍໄດ້ (3μg/ml) ແລະ IL-2 (300 U/ml; Proleukin) ເປັນເວລາ 3 ມື້. ຫຼັງຈາກ 3 ມື້, ຈຸລັງໄດ້ຖືກເກັບກຳ ແລະ ລ້າງດ້ວຍນ້ຳເຄັມ 0.9%, ແລະ pellet ໄດ້ຖືກແຊ່ແຂງໄວ. ການນັບຈຳນວນຈຸລັງໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍ flow cytometry (Cytek Aurora; ການຕັ້ງຄ່າ 3L-16V-14B-8R) ໂດຍໃຊ້ 123count eBeads.
ສານສະກັດເມຕາໂບໄລທ໌ຕາມທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ຂ້າງເທິງ. ສານສະກັດແຫ້ງໄດ້ຖືກປະສົມຄືນໃໝ່ໃນຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ 4000 ເຊວທຽບເທົ່າ/μl. ວິເຄາະຕົວຢ່າງໂດຍໂຄຣມາໂຕກຣາຟີແບບປີ້ນກັບກັນ (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ແລະຖັນ CORTECS T3 (2.1×150 ມມ, ຂະໜາດອະນຸພາກ 1.6-μm, ຂະໜາດຮູຂຸມຂົນ 120-Å; #186008500, Waters). ເຄື່ອງວັດແທກມວນສານຂົ້ວໂລກ (6470, Agilent), ເຊິ່ງການໄອອອນແບບເອເລັກໂຕຣສະເປຣເຮັດວຽກໃນຮູບແບບບວກ. ໄລຍະເຄື່ອນທີ່ A ແມ່ນ 0.1% ກົດຟໍມິກ (ໃນ H2O), ໄລຍະເຄື່ອນທີ່ B ແມ່ນ 90% ອາເຊໂຕໄນໄຕຣ, 0.1% ກົດຟໍມິກ. ຄວາມຜັນຜວນ LC ແມ່ນ 0 ຫາ 2 ນາທີ ສຳລັບ 100% A, 2 ຫາ 7.1 ນາທີ ສຳລັບ 99% B, ແລະ 7.1 ຫາ 8 ນາທີ ສຳລັບ 99% B. ຈາກນັ້ນ, ປັບສົມດຸນຖັນຄືນໃໝ່ດ້ວຍໄລຍະເຄື່ອນທີ່ A ທີ່ອັດຕາການໄຫຼ 0.6 ml/ນາທີ ເປັນເວລາ 3 ນາທີ. ອັດຕາການໄຫຼແມ່ນ 0.4 ml/ນາທີ, ແລະ ຫ້ອງຖັນຖືກໃຫ້ຄວາມຮ້ອນເຖິງ 50°C. ໃຊ້ມາດຕະຖານເຄມີບໍລິສຸດຂອງ MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) ເພື່ອກຳນົດເວລາຮັກສາ (RT) ແລະ ການຫັນປ່ຽນ (RT = 0.882 ນາທີ, ການຫັນປ່ຽນ 1 = 137→94.1, ການຫັນປ່ຽນ 2 = 137→92, ການຫັນປ່ຽນ 3 = 137→78). ເມື່ອການຫັນປ່ຽນທັງສາມເກີດຂຶ້ນໃນເວລາຮັກສາທີ່ຖືກຕ້ອງ, ການຫັນປ່ຽນ 1 ຈະຖືກໃຊ້ສຳລັບການວັດປະລິມານເພື່ອຮັບປະກັນຄວາມຈຳເພາະ. ເສັ້ນໂຄ້ງມາດຕະຖານຂອງ MNA (ບໍລິສັດເຄມີຄົ້ນຄວ້າໂຕຣອນໂຕ) ໄດ້ຖືກສ້າງຂຶ້ນໂດຍການລະລາຍສານລະລາຍສະຕັອກ (1 ມກ/ມລ) ຫົກຄັ້ງເພື່ອໃຫ້ໄດ້ມາດຕະຖານຂອງແຫຼວ 0.1, 1.0, 10 ແລະ 100 ng/ມລ ແລະ 1.0 ແລະ 10μg/ມລ ຕາມລຳດັບ. ຂີດຈຳກັດການກວດຈັບແມ່ນ 1 ng/ມລ, ແລະການຕອບສະໜອງເສັ້ນຊື່ແມ່ນຢູ່ລະຫວ່າງ 10 ng/ມລ ແລະ 10μg/ມລ. ການສັກຕົວຢ່າງ ແລະ ມາດຕະຖານສອງໄມໂຄຣລິດແຕ່ລະຄັ້ງແມ່ນໃຊ້ສຳລັບການວິເຄາະ LC/MS, ແລະຕົວຢ່າງຄວບຄຸມຄຸນນະພາບປະສົມຈະຖືກດຳເນີນການທຸກໆແປດຄັ້ງເພື່ອຮັບປະກັນຄວາມໝັ້ນຄົງຂອງແພລດຟອມການວິເຄາະ. ການຕອບສະໜອງ MNA ຂອງຕົວຢ່າງເຊວທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ MNA ທັງໝົດແມ່ນຢູ່ພາຍໃນຂອບເຂດເສັ້ນຊື່ຂອງການວິເຄາະ. ການວິເຄາະຂໍ້ມູນໄດ້ເຮັດໂດຍໃຊ້ຊອບແວການວິເຄາະປະລິມານ MassHunter (v9.0, Agilent).
ໂຄງສ້າງ αFR-CAR ລຸ້ນທີສອງໄດ້ຖືກນຳມາຈາກ Song et al. (59). ໂດຍຫຍໍ້ແລ້ວ, ໂຄງສ້າງດັ່ງກ່າວປະກອບດ້ວຍເນື້ອໃນດັ່ງຕໍ່ໄປນີ້: ລຳດັບຜູ້ນຳ CD8a, ຊິ້ນສ່ວນຕົວແປລະບົບຕ່ອງໂສ້ດຽວຂອງມະນຸດ αFR, ພາກພື້ນ hinge ແລະ transmembrane ຂອງ CD8a, ໂດເມນພາຍໃນຈຸລັງ CD27 ແລະ ໂດເມນພາຍໃນຈຸລັງ CD3z. ລຳດັບ CAR ທີ່ສົມບູນໄດ້ຖືກສັງເຄາະໂດຍ GenScript, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນໄດ້ໂຄນເຂົ້າໄປໃນເວັກເຕີສະແດງອອກ lentiviral ລຸ້ນທີສອງຢູ່ທາງເທິງຂອງ cassette ສະແດງອອກ GFP ທີ່ໃຊ້ເພື່ອປະເມີນປະສິດທິພາບການຖ່າຍທອດ.
ເຊື້ອໄວຣັສ Lentivirus ແມ່ນຜະລິດໂດຍການຖ່າຍທອດຈຸລັງ HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC); ປູກໃນອາຫານກາງ Dulbecco's modified Eagle ທີ່ມີ serum ງົວໃນທ້ອງ (FBS) 10% ແລະ PenStrep 1%, ແລະໃຊ້ເວັກເຕີ CAR-GFP ແລະ plasmids ບັນຈຸ (psPAX2 ແລະ pMD2.G, Addgene) ໃຊ້ lipofection amine (Sigma-Aldrich). ສານລະລາຍທີ່ມີເຊື້ອໄວຣັສໄດ້ຖືກເກັບກຳ 48 ແລະ 72 ຊົ່ວໂມງຫຼັງຈາກການຖ່າຍທອດ, ກັ່ນຕອງ, ແລະ ເຂັ້ມຂຸ້ນໂດຍການປั่นແຍກດ້ວຍວິທີ ultracentrifugation. ເກັບຮັກສາສານລະລາຍໄວຣັດທີ່ເຂັ້ມຂຸ້ນໄວ້ທີ່ -80°C ຈົນກວ່າຈະຖ່າຍທອດ.
PBMC ຖືກແຍກອອກຈາກຜະລິດຕະພັນແຍກເມັດເລືອດຂາວຂອງຜູ້ໃຫ້ທີ່ມີສຸຂະພາບດີ (STEMCELL Technologies) ໂດຍການປั่นແຍກຄວາມໜາແໜ້ນຂອງ Ficoll gradient. ໃຊ້ລູກປັດຈຸບັດ CD8 ທີ່ມີການເລືອກໃນທາງບວກ (Miltenyi) ເພື່ອແຍກຈຸລັງ CD8+ ອອກຈາກ PBMC. ກະຕຸ້ນຈຸລັງ T ດ້ວຍ TransAct (Miltenyi) ແລະ ໃນສື່ກາງ TexMACS [Miltenyi; ເສີມດ້ວຍເຊລັ່ມຂອງມະນຸດທີ່ຖືກເຮັດໃຫ້ບໍ່ມີການເຄື່ອນໄຫວດ້ວຍຄວາມຮ້ອນ 3%, 1% PenStrep ແລະ IL-2 (300 U/ml)]. ຊາວສີ່ຊົ່ວໂມງຫຼັງຈາກການກະຕຸ້ນ, ຈຸລັງ T ໄດ້ຖືກປ່ຽນຖ່າຍດ້ວຍ lentivirus (ນ້ຳເຊື້ອໄວຣັດທີ່ມີຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ 10 μl ຕໍ່ 106 ຈຸລັງ). 1 ຫາ 3 ມື້ຫຼັງຈາກການປ່ຽນຖ່າຍໃນ Cytek Aurora (ໃນ FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), ປະເມີນການສະແດງອອກ GFP ຂອງຈຸລັງເພື່ອສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງປະສິດທິພາບການປ່ຽນຖ່າຍຢ່າງໜ້ອຍ 30%.
ຈຸລັງ CAR-T ໄດ້ຖືກเพาะเลี้ยงເປັນເວລາ 24 ຊົ່ວໂມງໃນ Immunocult (STEMCELL Technologies; ເສີມດ້ວຍ 1% PenStrep) ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂຕໍ່ໄປນີ້: ບໍ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວ, ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ adenosine 250 μM ຫຼື 10 mM MNA. ຫຼັງຈາກການປິ່ນປົວກ່ອນ, ຈຸລັງ CAR-T ໄດ້ຖືກລ້າງດ້ວຍ PBS ແລະລວມກັບຈຸລັງ SK-OV-3 20,000 ຈຸລັງ [ATCC; ໃນສື່ກາງ McCoy 5A (Sigma-Aldrich) ທີ່ເສີມດ້ວຍ 10% FBS ແລະ 1% PenStrep ທີ່ 10: ອັດຕາສ່ວນ effector ຕໍ່ເປົ້າໝາຍຂອງ 1 ໄດ້ຖືກຂະຫຍາຍເປັນສາມເທົ່າໃນສື່ກາງ Immunocult ທີ່ເສີມ. ຈຸລັງ SK-OV-3 ແລະຈຸລັງ SK-OV-3 ທີ່ຖືກລະລາຍດ້ວຍ digitalis saponin (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) ຖືກນໍາໃຊ້ເປັນຕົວຄວບຄຸມທາງລົບ ແລະ ທາງບວກຕາມລໍາດັບ. ຫຼັງຈາກການປູກຮ່ວມກັນ 24 ຊົ່ວໂມງ, ນ້ຳເຊວທີ່ຖືກເກັບກຳໄດ້ຖືກເກັບກຳ ແລະ lactate dehydrogenase (LDH) ໄດ້ຖືກວັດແທກຕາມຄຳແນະນຳຂອງຜູ້ຜະລິດ (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). ນ້ຳເຊວທີ່ຖືກລະລາຍ LDH ໃນອັດຕາ 1:50 ໃນບັຟເຟີ LDH. ອັດຕາສ່ວນຂອງການຂ້າໄດ້ຖືກວັດແທກໂດຍໃຊ້ສູດຕໍ່ໄປນີ້: ອັດຕາສ່ວນຂອງການຂ້າ = ອັດຕາສ່ວນຂອງການແກ້ໄຂ / ອັດຕາການຂ້າສູງສຸດ x 100%, ເຊິ່ງອັດຕາສ່ວນຂອງການແກ້ໄຂ = ຈຸລັງ T ທີ່ມີການเพาะเลี้ยงຮ່ວມກັນເທົ່ານັ້ນ, ແລະ ອັດຕາການຂ້າສູງສຸດ = ກຸ່ມຄວບຄຸມໃນທາງບວກ-ກຸ່ມຄວບຄຸມທາງລົບ.
ດັ່ງທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ໃນຂໍ້ຄວາມ ຫຼື ເອກະສານ ແລະ ວິທີການ, ໃຫ້ໃຊ້ GraphPad Prism 8, Microsoft Excel ຫຼື R v3.6.0 ສຳລັບການວິເຄາະທາງສະຖິຕິ. ຖ້າຕົວຢ່າງຫຼາຍອັນຖືກເກັບມາຈາກຄົນເຈັບຄົນດຽວກັນ (ເຊັ່ນ: ນ້ຳໃນທ້ອງ ແລະ ເນື້ອງອກ), ພວກເຮົາຈະໃຊ້ການທົດສອບ t ຄູ່ ຫຼື ລວມເອົາຄົນເຈັບເປັນຜົນກະທົບແບບສຸ່ມໃນຮູບແບບເສັ້ນຊື່ ຫຼື ທົ່ວໄປຕາມຄວາມເໝາະສົມ. ສຳລັບການວິເຄາະດ້ານ metabolomics, ການທົດສອບຄວາມສຳຄັນແມ່ນປະຕິບັດເປັນສາມເທົ່າ.
ສຳລັບເອກະສານເສີມສຳລັບບົດຄວາມນີ້, ກະລຸນາເບິ່ງ http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
ນີ້ແມ່ນບົດຄວາມທີ່ສາມາດເຂົ້າເຖິງໄດ້ໂດຍບໍ່ເສຍຄ່າ ເຊິ່ງແຈກຢາຍພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂຂອງໃບອະນຸຍາດ Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, ເຊິ່ງອະນຸຍາດໃຫ້ນຳໃຊ້, ແຈກຢາຍ ແລະ ສຳເນົາໃນສື່ໃດກໍໄດ້, ຕາບໃດທີ່ການນຳໃຊ້ສຸດທ້າຍບໍ່ແມ່ນເພື່ອຜົນປະໂຫຍດທາງການຄ້າ ແລະ ຫຼັກຖານແມ່ນວ່າຜົນງານຕົ້ນສະບັບຖືກຕ້ອງ. ອ້າງອີງ.
ໝາຍເຫດ: ພວກເຮົາພຽງແຕ່ຂໍໃຫ້ທ່ານໃຫ້ທີ່ຢູ່ອີເມວຂອງທ່ານເພື່ອໃຫ້ບຸກຄົນທີ່ທ່ານແນະນຳໃຫ້ກັບໜ້າເວັບຮູ້ວ່າທ່ານຕ້ອງການໃຫ້ເຂົາເຈົ້າເຫັນອີເມວ ແລະ ມັນບໍ່ແມ່ນສະແປມ. ພວກເຮົາຈະບໍ່ບັນທຶກທີ່ຢູ່ອີເມວໃດໆ.
ຄຳຖາມນີ້ແມ່ນໃຊ້ເພື່ອທົດສອບວ່າທ່ານເປັນຜູ້ມາຢ້ຽມຊົມຫຼືບໍ່ ແລະ ປ້ອງກັນການສົ່ງສະແປມໂດຍອັດຕະໂນມັດ.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), J.Ralpher Dellini (Ralph J.R. Dell) G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA ປະກອບສ່ວນເຂົ້າໃນການສະກັດກັ້ນພູມຕ້ານທານຂອງຈຸລັງ T ແລະ ເປັນຕົວແທນຂອງເປົ້າໝາຍການປິ່ນປົວດ້ວຍພູມຕ້ານທານທີ່ມີທ່າແຮງສຳລັບການປິ່ນປົວມະເຮັງຂອງມະນຸດ.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), J.Ralpher Dellini (Ralph J.R. Dell) G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA ປະກອບສ່ວນເຂົ້າໃນການສະກັດກັ້ນພູມຕ້ານທານຂອງຈຸລັງ T ແລະ ເປັນຕົວແທນຂອງເປົ້າໝາຍການປິ່ນປົວດ້ວຍພູມຕ້ານທານທີ່ມີທ່າແຮງສຳລັບການປິ່ນປົວມະເຮັງຂອງມະນຸດ.
© 2021 ສະມາຄົມອາເມລິກາເພື່ອຄວາມກ້າວໜ້າຂອງວິທະຍາສາດ. ສະຫງວນລິຂະສິດທັງໝົດ. AAAS ເປັນຄູ່ຮ່ວມງານຂອງ HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ແລະ COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.