ຂອບໃຈທີ່ທ່ານເຂົ້າມາຢ້ຽມຊົມ Nature.com. ໂປຣແກຣມທ່ອງເວັບລຸ້ນທີ່ທ່ານກຳລັງໃຊ້ຢູ່ມີການຮອງຮັບ CSS ທີ່ຈຳກັດ. ເພື່ອປະສົບການທີ່ດີທີ່ສຸດ, ພວກເຮົາແນະນຳໃຫ້ທ່ານໃຊ້ໂປຣແກຣມທ່ອງເວັບທີ່ອັບເດດແລ້ວ (ຫຼືປິດໂໝດຄວາມເຂົ້າກັນໄດ້ໃນ Internet Explorer). ໃນລະຫວ່າງນີ້, ເພື່ອຮັບປະກັນການສະໜັບສະໜູນຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງ, ພວກເຮົາຈະສະແດງເວັບໄຊໂດຍບໍ່ມີຮູບແບບ ແລະ JavaScript.
ບໍ່ເຫມືອນກັບສັດກະດູກສັນຫຼັງ, ແມງໄມ້ຖືກຄິດຢ່າງກວ້າງຂວາງວ່າຂາດຮໍໂມນສະເຕີຣອຍເພດຊາຍທີ່ມີອະຄະຕິ. ໃນ Anopheles gambiae, ຢາສະເຕີຣອຍ ecdysone 20-hydroxyecdysone (20E) ເບິ່ງຄືວ່າໄດ້ພັດທະນາເພື່ອຄວບຄຸມການພັດທະນາໄຂ່ເມື່ອຖືກສັງເຄາະໂດຍເພດຍິງ2 ແລະເພື່ອກະຕຸ້ນໄລຍະເວລາທີ່ທົນທານຕໍ່ການຫາຄູ່ເມື່ອຖືກຖ່າຍທອດທາງເພດໂດຍເພດຊາຍ3. ເນື່ອງຈາກການພັດທະນາໄຂ່ແລະການຫາຄູ່ແມ່ນລັກສະນະການສືບພັນທີ່ສຳຄັນ, ການເຂົ້າໃຈວິທີທີ່ຍຸງ Anopheles ເພດຍິງປະສົມປະສານສັນຍານຮໍໂມນເຫຼົ່ານີ້ສາມາດອຳນວຍຄວາມສະດວກໃນການອອກແບບໂຄງການຄວບຄຸມໄຂ້ມາເລເຣຍໃໝ່. ໃນທີ່ນີ້, ພວກເຮົາເປີດເຜີຍວ່າໜ້າທີ່ການສືບພັນເຫຼົ່ານີ້ຖືກຄວບຄຸມໂດຍຢາສະເຕີຣອຍເພດທີ່ແຕກຕ່າງກັນຜ່ານເຄືອຂ່າຍທີ່ສັບສົນຂອງເອນໄຊ ecdysteroid-activating/inactivating. ພວກເຮົາໄດ້ລະບຸຢາ ecdysone ທີ່ຖືກຜຸພັງສະເພາະເພດຊາຍ, 3-dehydro-20E (3D20E), ເຊິ່ງປົກປ້ອງການເປັນພໍ່ແມ່ໂດຍການປິດການຮັບທາງເພດຂອງເພດຍິງຫຼັງຈາກການຖ່າຍທອດທາງເພດແລະການກະຕຸ້ນໂດຍ dephosphorylation. ໂດຍສະເພາະ, ການໂອນ 3D20E ຍັງກະຕຸ້ນການສະແດງອອກຂອງເຊື້ອພັນທຸກໍາການສືບພັນທີ່ຮັກສາການພັດທະນາໄຂ່ໃນລະຫວ່າງການຕິດເຊື້ອ Plasmodium, ຮັບປະກັນສຸຂະພາບຂອງເພດຍິງທີ່ຕິດເຊື້ອ. 20E ທີ່ມາຈາກເພດຍິງບໍ່ໄດ້ກະຕຸ້ນ ການຕອບສະໜອງທາງເພດ, ແຕ່ອະນຸຍາດໃຫ້ບຸກຄົນປະສົມພັນວາງໄຂ່ຫຼັງຈາກໄຄເນສທີ່ຍັບຍັ້ງ 20E ຖືກຍັບຍັ້ງ. ການລະບຸຮໍໂມນສະເຕີຣອຍແມງໄມ້ສະເພາະເພດຊາຍນີ້ ແລະ ບົດບາດຂອງມັນໃນການຄວບຄຸມການຮັບທາງເພດຂອງເພດຍິງ, ການຈະເລີນພັນ ແລະ ການພົວພັນກັບ Plasmodium ຊີ້ໃຫ້ເຫັນເຖິງທ່າແຮງທີ່ຈະຫຼຸດຜ່ອນຄວາມສຳເລັດໃນການສືບພັນຂອງຍຸງທີ່ແຜ່ເຊື້ອໄຂ້ມາເລເຣຍ.
ກໍລະນີໄຂ້ຍຸງ ແລະ ການເສຍຊີວິດກຳລັງເພີ່ມຂຶ້ນອີກ4 ເນື່ອງຈາກການຕ້ານທານຢາຂ້າແມງໄມ້ຢ່າງແຜ່ຫຼາຍໃນຍຸງ Anopheles, ເຊິ່ງເປັນພາຫະນຳເຊື້ອດຽວຂອງແມ່ກາຝາກໄຂ້ຍຸງໃນມະນຸດ. ຊີວະວິທະຍາການຫາຄູ່ຂອງຍຸງເຫຼົ່ານີ້ແມ່ນເປົ້າໝາຍທີ່ໜ້າສົນໃຈໂດຍສະເພາະສຳລັບການແຊກແຊງຄວບຄຸມໄຂ້ຍຸງແບບໃໝ່ ເພາະວ່າຍຸງເພດແມ່ຫາຄູ່ພຽງຄັ້ງດຽວ5; ການເຮັດໃຫ້ເຫດການການຫາຄູ່ຄັ້ງດຽວນີ້ເປັນຫມັນຈະມີທ່າແຮງອັນໃຫຍ່ຫຼວງໃນການຫຼຸດຜ່ອນປະຊາກອນຍຸງໃນທົ່ງນາ.
ຜູ້ຍິງຈະກາຍເປັນຄົນພິການທາງເພດຫຼັງຈາກໄດ້ຮັບຮໍໂມນສະເຕີຣອຍທີ່ມີລະດັບ titer ສູງຈາກຜູ້ຊາຍ. ການສຶກສາໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າຕົວກະຕຸ້ນໃຫ້ມີຄວາມຫຍຸ້ງຍາກໃນການຫາຄູ່ຕໍ່ໄປແມ່ນ 20-hydroxyecdysone (20E), ເຊິ່ງເປັນຮໍໂມນສະເຕີຣອຍທີ່ຮູ້ຈັກກັນດີໃນນາມຕົວຄວບຄຸມວົງຈອນການລອກຂົນໃນໄລຍະຕົວອ່ອນ. ຄວາມສາມາດຂອງເພດຊາຍໃນການສັງເຄາະ ແລະ ໂອນຍ້າຍ 20E ໄດ້ພັດທະນາໂດຍສະເພາະໃນຊະນິດ Anopheles ທີ່ເປັນສ່ວນໜຶ່ງຂອງສະກຸນຍ່ອຍ Cellia7, ເຊິ່ງແຈກຢາຍຢູ່ໃນອາຟຣິກາ ແລະ ປະກອບມີພາຫະນຳທີ່ເປັນອັນຕະລາຍທີ່ສຸດຂອງໄຂ້ມາເລເຣຍ, ລວມທັງ Anopheles gambiae. ນີ້ແມ່ນໜ້າສັງເກດໂດຍສະເພາະເພາະວ່າໃນຊະນິດເຫຼົ່ານີ້ ເພດຍິງຍັງຜະລິດ 20E ຫຼັງຈາກກິນອາຫານເລືອດແຕ່ລະຄັ້ງ, ແລະ 20E ຂັບເຄື່ອນວົງຈອນການສ້າງໄຂ່ (ເບິ່ງເອກະສານອ້າງອີງ 8). ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ມີຄວາມຮູ້ໜ້ອຍກ່ຽວກັບວິທີທີ່ເພດຍິງປະສົມປະສານສັນຍານຈາກສອງແຫຼ່ງທີ່ແຕກຕ່າງກັນຂອງ ecdysone (ການໂອນຍ້າຍເພດຊາຍ ແລະ ການກະຕຸ້ນການໃຫ້ອາຫານເລືອດ) ໂດຍບໍ່ມີການປະນີປະນອມຄວາມສາມາດໃນການຫາຄູ່ຂອງຕົນເອງ. ໃນຄວາມເປັນຈິງ, ຖ້າ 20E ທີ່ຜະລິດໂດຍເພດຍິງກະຕຸ້ນການບໍ່ທົນທານຕໍ່ທາງເພດ, ສິ່ງນີ້ຈະນໍາໄປສູ່ການເປັນຫມັນໃນບຸກຄົນທີ່ລ້ຽງລູກດ້ວຍນົມແມ່, ເຊິ່ງເປັນພຶດຕິກໍາທີ່ພົບເລື້ອຍຫຼາຍໃນຍຸງເຫຼົ່ານີ້5.
ຄຳອະທິບາຍທີ່ເປັນໄປໄດ້ແມ່ນວ່າ A. gambiae ເພດຜູ້ໂອນ ecdysone ທີ່ຖືກດັດແປງສະເພາະເພດຜູ້, ເຊິ່ງກະຕຸ້ນສາຍສັນຍານໃນລະບົບສືບພັນຂອງເພດຍິງ, ເຊິ່ງສົ່ງຜົນໃຫ້ຄວາມບໍ່ສະຖຽນລະພາບຂອງການຫາຄູ່. ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ເຖິງແມ່ນວ່າສັດມີກະດູກສັນຫຼັງມີຮໍໂມນສະເຕີຣອຍຫຼາຍຊະນິດ, ເຊັ່ນ estrogen ແລະ androgen (ທົບທວນໃນເອກະສານອ້າງອີງທີ 9), ຕາມຄວາມຮູ້ຂອງພວກເຮົາ, ສະເຕີຣອຍທີ່ມີອະຄະຕິ androgenic ຍັງບໍ່ທັນໄດ້ຖືກລະບຸໃນແມງໄມ້.
ພວກເຮົາໄດ້ກຳນົດລາຍຊື່ຂອງຮໍໂມນສະເຕີຣອຍໃນຕ່ອມເສີມເພດຊາຍ (MAG) ຂອງ A. gambiae ທີ່ເຕີບໃຫຍ່ເຕັມທີ່ເພື່ອຄົ້ນຫາສະເຕີຣອຍທີ່ດັດແປງໄດ້. ການໃຊ້ໂຄຣມາໂຕກຣາຟີແຫຼວປະສິດທິພາບສູງຮ່ວມກັບການວິເຄາະມວນສານ tandem (HPLC-MS/MS) ແທນທີ່ຈະເປັນວິທີການທີ່ບໍ່ເຈາະຈົງທີ່ໃຊ້ກ່ອນໜ້ານີ້, ພວກເຮົາໄດ້ກວດພົບ ecdysone (E) ແລະ 20E ໃນເນື້ອເຍື່ອນີ້, ເຊິ່ງຢືນຢັນຜົນໄດ້ຮັບກ່ອນໜ້ານີ້. ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກຄອບງຳໂດຍສະເຕີຣອຍທີ່ມີຟອສຟໍຣິເລດທີ່ຖືກຜຸພັງ, ສອດຄ່ອງກັບສູດ 3-dehydro-20E-22-phosphate (3D20E22P)12 (ຮູບທີ 1). ຮູບແບບອື່ນໆລວມມີ 3-dehydro-20E (3D20E) ແລະ 20E-22-phosphate (20E22P). ຄວາມເຂັ້ມຂອງສັນຍານ HPLC-MS/MS ຂອງ 3D20E22P ແມ່ນສູງກວ່າຮູບແບບ dephosphorylated ສອງລຳດັບຂອງຂະໜາດ, 3D20E, ແລະສູງກວ່າ E ແລະ 20E ສາມລຳດັບຂອງຂະໜາດ (ຮູບທີ 1). ເຖິງແມ່ນວ່າໃນສ່ວນອື່ນໆ ຂອງຮ່າງກາຍ ແລະ ລະບົບສືບພັນສ່ວນລຸ່ມ (LRT; ຮູບທີ 1a). ພວກເຮົາຍັງໄດ້ວິເຄາະ ecdysteroids ໃນເພດຊາຍ ແລະ ເພດຍິງທີ່ຫາກໍ່ປິດໃໝ່ (ອາຍຸຕໍ່າກວ່າ 1 ມື້) ແລະ ກວດພົບ 3D20E ແລະ 3D20E22P ສະເພາະໃນ MAG; E, 20E ແລະ 20E22P ມີຢູ່ໃນທັງສອງເພດ (ຮູບທີ 1b). ຂໍ້ມູນເຫຼົ່ານີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າເພດຊາຍຜູ້ໃຫຍ່ A. gambiae ຜະລິດຮໍໂມນດັດແປງທີ່ມີລະດັບສູງໃນ MAGs ຂອງພວກມັນທີ່ບໍ່ໄດ້ຖືກສັງເຄາະໂດຍເພດຍິງ.
MAG ແລະ LRT ເພດແມ່ (ລວມທັງ atria, seminal vesicles, ແລະ parovarium) ໄດ້ຖືກຜ່າຕັດຈາກເພດຜູ້ບໍລິສຸດອາຍຸ 4 ມື້ (ອາຍຸ 4 ມື້) ແລະ ເພດແມ່ບໍລິສຸດ ແລະ ບໍລິສຸດທີ່ຫາຄູ່ແລ້ວ (0.5, 3, ແລະ 12 hpm). Ecdysone ໃນເນື້ອເຍື່ອເຫຼົ່ານີ້ໄດ້ຖືກວິເຄາະໂດຍ HPLC-MS/MS (ຄ່າສະເລ່ຍ ± sem; unpaired t-test, two-sided, false discovery rate (FDR) ຖືກແກ້ໄຂແລ້ວ; NS, ບໍ່ສຳຄັນ; *P < 0.05, **P < 0.01. 3D20E: 3 ຊົ່ວໂມງ ທຽບກັບ 0.5 ຊົ່ວໂມງ, P = 0.035; 12 ຊົ່ວໂມງ ທຽບກັບ 3 ຊົ່ວໂມງ, P = 0.0015; 12 ຊົ່ວໂມງ ທຽບກັບ 0.5 ຊົ່ວໂມງ, P = 0.030. 3D20E22P: 3 ຊົ່ວໂມງ ທຽບກັບ 0.5 ຊົ່ວໂມງ, P = 0.25; 12 ຊົ່ວໂມງ ທຽບກັບ 3 ຊົ່ວໂມງ, P = 0.0032; 12 ຊົ່ວໂມງ ທຽບກັບ 0.5 ຊົ່ວໂມງ, P = 0.015). ຂໍ້ມູນແມ່ນມາຈາກສາມສຳເນົາທາງຊີວະວິທະຍາ. ພື້ນທີ່ສູງສຸດສຳລັບແຕ່ລະ ecdysone ທີ່ສົນໃຈໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ ແລະ ປັບໃຫ້ເປັນປົກກະຕິໂດຍຈຳນວນຍຸງ. Ecdysone ຖືກສະແດງດ້ວຍສີດັ່ງຕໍ່ໄປນີ້: E, ສີຂຽວ; 20E, ສີສົ້ມ; 20E22P, ສີມ່ວງ; 3D20E, ສີຟ້າ; 3D20E22P, ສີບົວ. ຮູບທີ່ໃສ່ເຂົ້າໄປເພີ່ມຂະໜາດໃນແກນ y ເພື່ອສະແດງລະດັບ ecdysone ທີ່ຕ່ຳກວ່າ.
ເພື່ອສືບສວນວ່າ 3D20E22P ແລະ 3D20E ຖືກໂອນໃນລະຫວ່າງການຫາຄູ່ຫຼືບໍ່, ພວກເຮົາໄດ້ຜ່າຕັດ LRT ເພດຍິງໃນຈຸດເວລາຕ່າງໆຫຼັງຈາກການຫາຄູ່. ເຖິງແມ່ນວ່າ ecdysone ບໍ່ພົບໃນປາບໍລິສຸດ, ພວກເຮົາໄດ້ສັງເກດເຫັນປະລິມານ 3D20E22P ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນ LRT ທັນທີຫຼັງຈາກການຫາຄູ່ (0.5 ຊົ່ວໂມງຫຼັງຈາກການຫາຄູ່, hpm), ຫຼຸດລົງຕາມການເວລາ, ໃນຂະນະທີ່ລະດັບ 3D20E ເພີ່ມຂຶ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ (ຮູບທີ 1). ໂດຍໃຊ້ 3D20E ທີ່ສັງເຄາະທາງເຄມີເປັນມາດຕະຖານ, ພວກເຮົາໄດ້ກຳນົດວ່າລະດັບຂອງຮໍໂມນສະເຕີຣອຍນີ້ໃນ LRT ການຫາຄູ່ສູງກວ່າ 20E ຢ່າງໜ້ອຍ 100 ເທົ່າ (ຕາຕະລາງຂໍ້ມູນທີ່ຂະຫຍາຍອອກ 1). ດັ່ງນັ້ນ, 3D20E22P ແມ່ນ ecdysone ເພດຊາຍຫຼັກທີ່ຖືກໂອນໄປຫາ LRT ເພດຍິງໃນລະຫວ່າງການຫາຄູ່, ແລະຮູບແບບ dephosphorylated ຂອງມັນ, 3D20E, ຈະມີຢູ່ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍບໍ່ດົນຫຼັງຈາກການຫາຄູ່. ນີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນບົດບາດສຳຄັນສຳລັບ ecdysone ສຸດທ້າຍໃນຊີວະວິທະຍາຫຼັງການຫາຄູ່ຂອງເພດຍິງ.
ຫຼັງຈາກສ້າງຊຸດຂໍ້ມູນການຈັດລໍາດັບ RNA (RNA-seq) ໃໝ່ (ຮູບທີ 2a), ໂດຍໃຊ້ທໍ່ສົ່ງຊີວະວິທະຍາຂໍ້ມູນຂ່າວສານທີ່ສ້າງຂຶ້ນເອງ, ພວກເຮົາໄດ້ຄົ້ນຫາ ecdysone kinase (EcK), ecdysone oxidase (EO), ແລະ ecdysone ທີ່ເຂົ້າລະຫັດ 20E-modified phosphatase gene.EPP) ຖືກສະແດງອອກໃນເນື້ອເຍື່ອສືບພັນ. ພວກເຮົາໄດ້ລະບຸ gene EPP ໜຶ່ງຕົວ ແລະ gene EcK ທີ່ມີທ່າແຮງສອງຕົວ (EcK1 ແລະ EcK2), ແຕ່ບໍ່ສາມາດຊອກຫາ gene EO ທີ່ດີໄດ້. ໂດຍສະເພາະ, gene EPP ແຕ່ລະຕົວໄດ້ສະແດງອອກໃນລະດັບສູງ (98.9th percentile) ໃນ Gambian MAGs ແຕ່ບໍ່ແມ່ນໃນ LRTs ເພດຍິງ (ຮູບທີ 2b), ກົງກັນຂ້າມກັບຄວາມຄາດຫວັງຂອງພວກເຮົາເນື່ອງຈາກ dephosphorylation ຂອງ 3D20E22P ເກີດຂຶ້ນໃນເນື້ອເຍື່ອເພດຍິງນີ້. ດັ່ງນັ້ນ, ພວກເຮົາເຊື່ອວ່າ EPP ເພດຊາຍອາດຈະຖືກໂອນໃນລະຫວ່າງການຫາຄູ່. ແທ້ຈິງແລ້ວ, ພວກເຮົາໄດ້ໃຊ້ການຕິດສະຫຼາກໄອໂຊໂທບທີ່ໝັ້ນຄົງໃນຮ່າງກາຍເພື່ອປິດບັງໂປຣຕີນເພດຍິງຫຼັງຈາກການຫາຄູ່, ເອນໄຊທີ່ລະບຸໂດຍ MS ໃນ atrium ເພດຍິງ (ຮູບທີ 2c ແລະ ຕາຕະລາງເສີມ 1). ການມີ EPP ໃນ MAG ແລະ LRT ເພດແມ່ທີ່ຫາຄູ່ (ແຕ່ບໍ່ແມ່ນເພດຍິງບໍລິສຸດ) ຍັງໄດ້ຮັບການຢືນຢັນໂດຍໃຊ້ພູມຕ້ານທານສະເພາະ (ຮູບທີ 2d).
ກ, ທໍ່ສົ່ງຊີວະວິທະຍາຂໍ້ມູນຂ່າວສານທີ່ສ້າງຂຶ້ນເອງເພື່ອຄົ້ນຫາເນື້ອເຍື່ອສືບພັນຂອງແຕ່ລະເພດເພື່ອຊອກຫາຍີນທີ່ເຂົ້າລະຫັດ EcKs, EOs, ແລະ EPPs. ຕົວເລກທີ່ຢູ່ຖັດຈາກລູກສອນຊີ້ບອກຈຳນວນຂອງເພດຊາຍ ແລະ ເພດຍິງທີ່ເປັນຕົວເລືອກໃນແຕ່ລະຂັ້ນຕອນ. ການວິເຄາະນີ້ໄດ້ລະບຸຍີນ EPP ໜຶ່ງ (EPP) ແລະ ຍີນ EcK ໜຶ່ງ (EcK1) ທີ່ສະແດງອອກໃນເພດຊາຍ, ແລະ ຍີນ EcK ໜຶ່ງ (EcK2) ທີ່ສະແດງອອກໃນທັງສອງເພດແຕ່ບໍ່ໃຫ້ຍີນ EO ທີ່ເປັນຕົວເລືອກ. ຂ, ແຜນທີ່ຄວາມຮ້ອນປຽບທຽບການສະແດງອອກຂອງຍີນທີ່ເປັນຕົວເລືອກໃນເນື້ອເຍື່ອທີ່ບໍລິສຸດ (V) ແລະ ເນື້ອເຍື່ອທີ່ຫາຄູ່ (M) ຂອງ Anopheles gambiae ແລະ Anopheles albicans. Spca, ການປະສົມພັນ; MAGs, ຕ່ອມເສີມໃນເພດຊາຍ; ສ່ວນອື່ນໆຂອງຮ່າງກາຍ, ລວມທັງເຕົ້ານົມ, ປີກ, ຂາ, ຮ່າງກາຍທີ່ມີໄຂມັນ, ແລະອະໄວຍະວະພາຍໃນໃນທັງສອງເພດ, ແລະຮວຍໄຂ່ໃນເພດຍິງ. EcK2 ສະແດງອອກສູງໃນທັງ MAG ແລະ atria ຂອງແກມເບຍ, ໃນຂະນະທີ່ EPP ພົບພຽງແຕ່ໃນ MAG.c, ການວິເຄາະໂປຣຕີນຂອງການຍ້າຍກຸ່ມອະສຸຈິຂອງເພດຊາຍເຂົ້າໄປໃນ atria ຂອງເພດຍິງທີ່ 3, 12 ແລະ 24 hpm, ສະແດງໃຫ້ເຫັນໂປຣຕີນທີ່ອຸດົມສົມບູນທີ່ສຸດ 67 ຊະນິດ. ເພດຍິງໄດ້ຖືກລ້ຽງດ້ວຍອາຫານທີ່ມີ 15N ເພື່ອຕິດປ້າຍ (ແລະປິດບັງ) ໂປຣຕີນທັງໝົດ. ເພດຊາຍທີ່ບໍ່ມີປ້າຍໄດ້ຖືກຈັບຄູ່ກັບເພດຍິງທີ່ມີປ້າຍ, ແລະ LRT ເພດຍິງໄດ້ຖືກຜ່າຕັດທີ່ 3, 12 ແລະ 24 hpm ສຳລັບການວິເຄາະໂປຣຕີນ (ເບິ່ງຕາຕະລາງເສີມ 1 ສຳລັບລາຍຊື່ທີ່ສົມບູນຂອງໂປຣຕີນທີ່ອະສຸຈິ). ລາຍລະອຽດເພີ່ມເຕີມ, EPP, Eck1 ແລະ EcK2 ໄດ້ຖືກກວດພົບໃນ MAG ຂອງເພດຊາຍບໍລິສຸດໂດຍການວິເຄາະໂປຣຕີນຂອງເນື້ອເຍື່ອເຫຼົ່ານີ້.d, EPP ໄດ້ຖືກກວດພົບໂດຍ western blot ໃນ MAG ແລະ LRT ຂອງເພດຍິງທີ່ແຕ່ງງານແລ້ວ, ແຕ່ບໍ່ແມ່ນໃນເພດຍິງບໍລິສຸດ ຫຼື ເພດຊາຍ ຫຼື ສ່ວນທີ່ເຫຼືອຂອງຮ່າງກາຍຂອງເພດຍິງ. ເຍື່ອຫຸ້ມໄດ້ພ້ອມໆກັນ ກວດສອບດ້ວຍພູມຕ້ານທານຕ້ານແອກຕິນ (ຕົວຄວບຄຸມການໂຫຼດ) ແລະ ພູມຕ້ານທານຕ້ານ EPP. ເພດຊາຍທັງໝົດແມ່ນບໍລິສຸດ. ເບິ່ງຮູບເສີມທີ 1 ສຳລັບຂໍ້ມູນແຫຼ່ງເຈວ. ການກວດ Western blots ໄດ້ຖືກປະຕິບັດສອງຄັ້ງດ້ວຍຜົນໄດ້ຮັບທີ່ຄ້າຍຄືກັນ.
ກິດຈະກຳ ecdysteroid phosphophosphatase ຂອງ EPP ໄດ້ຮັບການຢັ້ງຢືນຫຼັງຈາກການຟັກໂດຍ HPLC-MS/MS ດ້ວຍ 3D20E22P ທີ່ແຍກອອກມາຈາກ MAG (ຮູບທີ 2a). ຍິ່ງໄປກວ່ານັ້ນ, ເມື່ອພວກເຮົາເຮັດໃຫ້ EPP ງຽບລົງໂດຍການແຊກແຊງທີ່ໄກ່ເກ່ຍໂດຍ RNA (RNAi), ພວກເຮົາໄດ້ກວດພົບການຫຼຸດລົງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍຂອງກິດຈະກຳ phosphatase ໃນເນື້ອເຍື່ອສືບພັນຂອງຍຸງເພດຜູ້ເຫຼົ່ານີ້ (ຮູບທີ 3a), ແລະເພດຍິງທີ່ຈັບຄູ່ກັບເພດຊາຍທີ່ຖືກເຮັດໃຫ້ງຽບລົງໂດຍ EPP ສະແດງໃຫ້ເຫັນສັດສ່ວນທີ່ຕ່ຳກວ່າຂອງ 3D20E ທີ່ຫຼຸດລົງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ (ຮູບທີ 3b) ເຖິງວ່າຈະມີການເຮັດໃຫ້ງຽບລົງຂອງ gene ບາງສ່ວນ (ຮູບທີ 2b,c). ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, ພວກເຮົາບໍ່ໄດ້ກວດພົບການປ່ຽນແປງທີ່ສຳຄັນໃນອັດຕາສ່ວນ 20E22P/20E ໃນຍຸງດຽວກັນ, ເຊິ່ງອາດຈະຊີ້ບອກວ່າເອນໄຊມ໌ດັ່ງກ່າວມີຄວາມຈຳເພາະສຳລັບ 3D20E22P (ຮູບທີ 3b).
ກ, ກິດຈະກຳ phosphatase ຫຼຸດລົງໃນ MAG ທີ່ເກີດຈາກການປິດບັງ EPP ໂດຍໃຊ້ຕົວຄວບຄຸມ EPP RNA ສອງສາຍ (dsEPP) ຫຼື RNA GFP ສອງສາຍ (dsGFP). ກຸ່ມ MAG ຊາວກຸ່ມໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ໃນແຕ່ລະການຊໍ້າຊ້ອນ (P = 0.0046, ການທົດສອບ t ຄູ່, ສອງດ້ານ), ສະແດງໂດຍຈຸດແຍກຕ່າງຫາກ. ຂ, ເພດຍິງທີ່ຈັບຄູ່ກັບເພດຊາຍທີ່ປິດບັງ EPP ມີສັດສ່ວນຂອງ dephosphorylated 3D20E ຕໍ່າກວ່າຢ່າງຫຼວງຫຼາຍທີ່ 3 hpm (P = 0.0043, ການທົດສອບ t ບໍ່ໄດ້ຈັບຄູ່, ສອງດ້ານ), ໃນຂະນະທີ່ລະດັບ 20E ບໍ່ໄດ້ຮັບຜົນກະທົບ (P = 0.063, ບໍ່ໄດ້ຈັບຄູ່). ການທົດສອບ t, ສອງດ້ານ). ຂໍ້ມູນຖືກນຳສະເໜີເປັນຄ່າສະເລ່ຍ ± sem ຈາກສາມກຸ່ມຂອງເພດຍິງ 13, 16 ແລະ 19 ໂຕຕໍ່ໂຕ.c, ເພດຍິງທີ່ປະສົມພັນກັບເພດຊາຍທີ່ຖືກ EPP ຫ້າມມີອັດຕາການປະສົມພັນໃໝ່ສູງກວ່າຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ (P = 0.0002, ການທົດສອບທີ່ແນ່ນອນຂອງ Fisher, ສອງດ້ານ). ເພດຍິງຖືກບັງຄັບໃຫ້ປະສົມພັນກ່ອນເພື່ອຮັບປະກັນສະຖານະການປະສົມພັນຂອງພວກມັນ; 2 ມື້ຕໍ່ມາ, ພວກມັນໄດ້ຖືກຕິດຕໍ່ກັບເພດຊາຍຄົນອື່ນໆທີ່ມີອະສຸຈິດັດແປງພັນທຸກໍາເພື່ອປະເມີນອັດຕາການປະສົມພັນຄືນໃໝ່ໂດຍການກວດຫາ PCR ແບບປະລິມານຂອງ transgene.d, ເພດຍິງທີ່ກິນເລືອດທີ່ປະສົມພັນກັບເພດຊາຍທີ່ຖືກ EPP silenced ມີການຈະເລີນພັນຫຼຸດລົງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ (P < 0.0001; ການທົດສອບ Mann-Whitney, ສອງດ້ານ) ແລະ ຈຳນວນໄຂ່ຫຼຸດລົງເລັກນ້ອຍ (P = 0.088, ການທົດສອບ Mann-Whitney, ສອງດ້ານ), ໃນຂະນະທີ່ອັດຕາການວາງໄຂ່ບໍ່ໄດ້ຮັບຜົນກະທົບ (P = 0.94, ການທົດສອບ Fisher's exact, ສອງດ້ານ). ໃນທຸກໆແຜງ, n ສະແດງເຖິງຈຳນວນຕົວຢ່າງຍຸງທີ່ເປັນເອກະລາດທາງຊີວະພາບ.NS, ບໍ່ສຳຄັນ.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.
ຕໍ່ໄປ, ພວກເຮົາໄດ້ປະເມີນວ່າການຫຼຸດລົງຂອງ ecdysone ແມ່ນມີຄວາມສຳຄັນຕໍ່ການກະຕຸ້ນການຕ້ານທານການຫາຄູ່ໃນເພດຍິງຫຼືບໍ່. ໂດຍສະເພາະ, ເພດຍິງທີ່ຫາຄູ່ກັບເພດຊາຍທີ່ຂາດ EPP ໄດ້ຫາຄູ່ໃໝ່ໃນຄວາມຖີ່ສູງກວ່າເພດຍິງຄວບຄຸມຫຼາຍ (44.9%) ເມື່ອພົບກັບເພດຊາຍເພີ່ມເຕີມ (transgenic) (ຮູບທີ 3c). ພວກເຮົາຍັງໄດ້ສັງເກດເຫັນການຫຼຸດລົງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍຂອງການຈະເລີນພັນ (ຮູບທີ 3d, ຊ້າຍ) ແລະການຫຼຸດລົງເລັກນ້ອຍໃນຈຳນວນໄຂ່ທີ່ວາງໂດຍເພດຍິງເຫຼົ່ານີ້ (ຮູບທີ 3d, ກາງ), ໃນຂະນະທີ່ອັດຕາສ່ວນຂອງໄຂ່ທີ່ວາງໂດຍເພດຍິງ (ການຕອບສະໜອງອື່ນທີ່ເກີດຂຶ້ນໃນເພດຍິງໂດຍການຫາຄູ່)) ບໍ່ໄດ້ຮັບຜົນກະທົບ (ຮູບທີ 3d, ຂວາ). ເນື່ອງຈາກຄວາມຈຳເພາະທີ່ສັງເກດເຫັນໄດ້ຂອງ EPP ສຳລັບ 3D20E22P, ຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າການກະຕຸ້ນຂອງ 3D20E ໂດຍ EPP ທີ່ຖືກໂອນໃນລະຫວ່າງການຫາຄູ່ອາດມີບົດບາດສຳຄັນໃນການປິດການເປີດຮັບຂອງເພດຍິງຕໍ່ການຫາຄູ່ຕື່ມອີກ, ພຶດຕິກຳທີ່ເຄີຍຖືກກຳນົດວ່າເປັນການໂອນທາງເພດຂອງ 20E. ດັ່ງນັ້ນ, ຮໍໂມນສະເພາະເພດຊາຍນີ້ຍັງມີຜົນກະທົບຢ່າງຫຼວງຫຼາຍຕໍ່ການຈະເລີນພັນຂອງເພດຍິງ.
ຕໍ່ໄປ, ພວກເຮົາໄດ້ປຽບທຽບກິດຈະກຳຂອງ 20E ແລະ 3D20E ໃນການທົດລອງສັກຢາໃນຜູ້ຍິງບໍລິສຸດທີ່ມີເພດສຳພັນໂດຍໃຊ້ 3D20E ທີ່ສັງເຄາະທາງເຄມີ (ຮູບທີ 4a–c) ແລະ 20E ທີ່ມີຢູ່ໃນທ້ອງຕະຫຼາດ. ພວກເຮົາສັງເກດເຫັນວ່າ 3D20E ມີປະສິດທິພາບຫຼາຍກ່ວາ 20E ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນການປິດຄວາມອ່ອນໄຫວຂອງເພດຍິງຕໍ່ການຫາຄູ່ທີ່ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນທັງສອງ (ຮູບທີ 4d). ສິ່ງທີ່ໜ້າສັງເກດແມ່ນເຄິ່ງໜຶ່ງຂອງລະດັບທາງສະລີລະວິທະຍາຂອງ 3D20E ໃນ LRT (1,066 pg ຫຼັງການສັກຢາ ທຽບກັບ 2,022 pg ຫຼັງການຫາຄູ່) ໄດ້ກະຕຸ້ນສັດສ່ວນຂອງເພດຍິງທີ່ດື້ຢາ ເຊິ່ງສູງກວ່າລະດັບທາງສະລີລະວິທະຍາຂອງ 20E (361 pg ຫຼັງການສັກຢາ) 24 ຊົ່ວໂມງຫຼັງຈາກການສັກຢາທີ່ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນສູງສຸດ 18 pg ຫຼັງການຫາຄູ່; ຕາຕະລາງຂໍ້ມູນທີ່ຂະຫຍາຍອອກ 1). ຜົນໄດ້ຮັບນີ້ສອດຄ່ອງກັບແນວຄວາມຄິດທີ່ວ່າການຖ່າຍທອດທາງເພດຂອງ 20E ບໍ່ໄດ້ເຮັດໃຫ້ເກີດໄລຍະເວລາທີ່ດື້ຢາໃນການຫາຄູ່, ແລະຊີ້ໃຫ້ເຫັນຕື່ມອີກວ່າ 3D20E ເປັນປັດໄຈຫຼັກໃນການຮັບປະກັນຄວາມສຳພັນລະຫວ່າງພໍ່ແມ່ແລະລູກ. 3D20E ຍັງມີການເຄື່ອນໄຫວຫຼາຍກ່ວາ 20E ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນການທົດສອບການວາງໄຂ່ໃນເພດຍິງທີ່ບໍລິສຸດ (ຮູບທີ 4e), ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າອັດຕາການວາງໄຂ່ປົກກະຕິທີ່ພວກເຮົາສັງເກດເຫັນຫຼັງຈາກການປິດ EPP ບາງສ່ວນແມ່ນຍ້ອນການມີກິດຈະກຳ 3D20E ທີ່ຍັງເຫຼືອຢູ່ທີ່ຍັງຜະລິດໂດຍປັດໄຈເພດຍິງທີ່ເກີດຈາກການຫາຄູ່.
(a,b) 3D20E ສັງເຄາະທາງເຄມີຈາກ 20E (a) ດ້ວຍການປ່ຽນແປງ/ປະສິດທິພາບສູງຫຼາຍ (ຂໍ້ມູນທີ່ນຳສະເໜີເປັນຄ່າສະເລ່ຍ ± sem ຈາກສາມປະຕິກິລິຍາສັງເຄາະເອກະລາດ) (b).c, ມວນສານ spectrum (ເຄິ່ງລຸ່ມ) ກົງກັບ ecdysone ທີ່ພົບໃນ LRT ເພດຍິງທີ່ຈັບຄູ່ (ເຄິ່ງເທິງ).d, ເມື່ອທຽບກັບ 20E (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; ການທົດສອບ Fisher's exact, ສອງດ້ານ) ແລະ 10% ethanol (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; ການທົດສອບ Fisher's exact, 2 ດ້ານ), ໃນຂະນະທີ່ 20E ສູງກວ່າກຸ່ມຄວບຄຸມຢ່າງຫຼວງຫຼາຍພຽງແຕ່ໃນປະລິມານທີ່ສູງກວ່າ (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; ການທົດສອບ Fisher's exact, 2 ດ້ານ).e, ການສັກຢາ 3D20E ກະຕຸ້ນອັດຕາການວາງໄຂ່ສູງຂຶ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນເພດຍິງທີ່ບໍລິສຸດກ່ວາກຸ່ມຄວບຄຸມເອທານອນ 10% (0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; ການທົດສອບແບບແນ່ນອນຂອງ Fisher, ສອງດ້ານ), ໃນຂະນະທີ່ 20E ເມື່ອທຽບກັບກຸ່ມຄວບຄຸມ ສະເພາະໃນປະລິມານທີ່ສູງກວ່າ (0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; ການທົດສອບແບບແນ່ນອນຂອງ Fisher, ສອງດ້ານ).3D20E ກະຕຸ້ນອັດຕາການວາງໄຂ່ສູງຂຶ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍກ່ວາ 20E ໃນປະລິມານທີ່ສູງກວ່າ (0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; ການທົດສອບແບບແນ່ນອນຂອງ Fisher, ສອງດ້ານ). ໃນທຸກໆແຜງ, n ສະແດງເຖິງຈຳນວນຕົວຢ່າງຍຸງທີ່ເປັນເອກະລາດທາງຊີວະພາບ.NS, ບໍ່ສຳຄັນ.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001. ຂໍ້ມູນແມ່ນມາຈາກສາມຊ້ຳກັນ.
ໃນການສຶກສາທີ່ຜ່ານມາ, ພວກເຮົາໄດ້ກຳນົດວ່າການໂອນຮໍໂມນສະເຕີຣອຍທາງເພດກະຕຸ້ນການສະແດງອອກຂອງ MISO (ຕົວກະຕຸ້ນການຈັບຄູ່ຂອງ Oogenesis 11), ເຊິ່ງເປັນພັນທຸກໍາສືບພັນຂອງເພດຍິງທີ່ປົກປ້ອງເພດຍິງ A. gambiae ຈາກການຕິດເຊື້ອ P. falciparum. ຄ່າໃຊ້ຈ່າຍດ້ານສຸຂະພາບທີ່ເກີດຈາກ 13, ປາສິດໄຂ້ຍຸງໃນມະນຸດທີ່ເປັນອັນຕະລາຍທີ່ສຸດ. ເນື່ອງຈາກຄວາມສໍາຄັນຂອງ MISO ຕໍ່ກັບຄວາມແຂງແຮງຂອງການສືບພັນຂອງ Anopheles ໃນເຂດທີ່ມີໄຂ້ຍຸງລະບາດ, ພວກເຮົາໄດ້ຕັດສິນໃຈກໍານົດຮໍໂມນ 3D20E ຫຼື 20E ທີ່ກະຕຸ້ນການສະແດງອອກຂອງພັນທຸກໍານີ້. ພວກເຮົາພົບວ່າໃນຂະນະທີ່ການສັກຢາ 20E ກະຕຸ້ນຕົວຮັບຮໍໂມນນິວເຄຼຍ (HR) ບາງຕົວໂດຍສະເພາະ ຫຼື ມີພະລັງຫຼາຍກວ່າ, ເຊັ່ນ HR3 ແລະ HR4, ແລະເປົ້າໝາຍສະເຕີຣອຍລຸ່ມນ້ຳທົ່ວໄປ, ເຊັ່ນ: ພັນທຸກໍາ yolkogenic Vg14, 15, 16, MISO ໄດ້ຖືກກະຕຸ້ນຢ່າງແຂງແຮງກວ່າໂດຍ 3D20E (ຮູບທີ 3). ດັ່ງນັ້ນ, ການໂອນຮໍໂມນສະເຕີຣອຍແອນໂດຣເຈນນີ້ທາງເພດເບິ່ງຄືວ່າຈະກະຕຸ້ນກົນໄກທີ່ປົກປ້ອງເພດຍິງຈາກຄ່າໃຊ້ຈ່າຍທີ່ເກີດຈາກການຕິດເຊື້ອປາສິດ. ຍິ່ງໄປກວ່ານັ້ນ, 3D20E ມີຜົນກະທົບແຕກຕ່າງກັນທັງ ໄອໂຊຟອມຂອງຕົວຮັບ E EcR, ກະຕຸ້ນ EcR-A ແລະສະກັດກັ້ນ EcR-B, ແລະກະຕຸ້ນຍີນທີ່ກະຕຸ້ນການຫາຄູ່ອື່ນໆຢ່າງແຂງແຮງ, ລວມທັງ HPX15, ເຊິ່ງສົ່ງຜົນກະທົບຕໍ່ການຈະເລີນພັນຂອງເພດຍິງ. ສິ່ງນີ້ສາມາດອະທິບາຍເຖິງການເປັນຫມັນທີ່ສຳຄັນທີ່ສັງເກດເຫັນໃນເພດຍິງທີ່ຫາຄູ່ກັບເພດຊາຍທີ່ຖືກ EPP ສະກັດກັ້ນ (ຮູບຂໍ້ມູນທີ່ຂະຫຍາຍອອກ 3). ຂໍ້ມູນເຫຼົ່ານີ້ຊີ້ບອກເຖິງການມີຢູ່ຂອງເສັ້ນທາງລຸ່ມທີ່ຖືກກະຕຸ້ນໂດຍຮໍໂມນ ecdysone ສອງຊະນິດທີ່ອາດຈະເປັນພື້ນຖານຂອງໜ້າທີ່ສະເພາະເພດ.
ຕໍ່ໄປ, ພວກເຮົາໄດ້ທົດສອບໜ້າທີ່ຂອງສອງ gene EcK ທີ່ລະບຸໄວ້ໃນທໍ່ສົ່ງຊີວະວິທະຍາຂໍ້ມູນຂອງພວກເຮົາ. ການປິດ EcK1 ຫຼື EcK2 ເຮັດໃຫ້ມີການຕາຍຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນເພດຊາຍ (Extended Data Fig. 4a), ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າການ phosphorylation ຂອງ ecdysone, ແລະດັ່ງນັ້ນການ inactivation, ແມ່ນສໍາຄັນຕໍ່ການຢູ່ລອດ. ເນື່ອງຈາກວ່າ EcK2 ຖືກສະແດງອອກໃນລະດັບທີ່ສູງກວ່າ EcK1 ແລະຖືກກວດພົບໃນ MAGs ໂດຍ proteomics (ຮູບທີ 2b, c ແລະຕາຕະລາງເສີມ 2), ພວກເຮົາໄດ້ກວດສອບກິດຈະກໍາ ecdysteroid kinase ຂອງມັນໂດຍການ incubating ມັນດ້ວຍ 20E, ເຊິ່ງເຮັດໃຫ້ເກີດ phosphorylation 20E22P (Extended Data Fig. 2).4b). ເມື່ອໃຊ້ 3D20E ເປັນ substrate, ພວກເຮົາບໍ່ສາມາດກວດພົບຜະລິດຕະພັນ phosphorylated 3D20E22P (Extended Data Fig. 4c), ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າ 20E ແທນທີ່ຈະເປັນ 3D20E ອາດເປັນເປົ້າຫມາຍທີ່ຕ້ອງການຂອງ EcK2.
ອີງຕາມການວິເຄາະ RNA-seq ຂອງພວກເຮົາ, EcK2 ຍັງສະແດງອອກສູງໃນ LRT ຂອງເພດຍິງທີ່ບໍລິສຸດ, ບ່ອນທີ່ມັນຖືກປິດຫຼັງຈາກການຫາຄູ່ (ຮູບທີ 2b). ພວກເຮົາໄດ້ຢືນຢັນຂໍ້ມູນເຫຼົ່ານີ້ ແລະ ກຳນົດວ່າການສະແດງອອກຂອງ EcK2 ບໍ່ໄດ້ຮັບຜົນກະທົບຈາກການໃຫ້ເລືອດ (ຂໍ້ມູນຂະຫຍາຍ ຮູບທີ 5a). ການຂະຫຍາຍການທົດລອງ MS ເບື້ອງຕົ້ນຂອງພວກເຮົາ, ພວກເຮົາໄດ້ກຳນົດວ່າຈຸດສູງສຸດຂອງ 20E22P ແມ່ນກ່ຽວຂ້ອງຢ່າງໃກ້ຊິດກັບຈຸດສູງສຸດຂອງ 20E (22-26 ຊົ່ວໂມງຫຼັງຈາກກິນອາຫານເລືອດ; ຂໍ້ມູນຂະຫຍາຍ ຮູບທີ 5b). ການປິດ EcK2 ໃນເພດຍິງທີ່ບໍລິສຸດເຮັດໃຫ້ອັດຕາສ່ວນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງຂອງ 20E ຕໍ່ 20E22P ເພີ່ມຂຶ້ນ 3 ເທົ່າທີ່ 26 ຊົ່ວໂມງຫຼັງຈາກກິນອາຫານເລືອດ (ຂໍ້ມູນຂະຫຍາຍ ຮູບທີ 2c ແລະ 5c), ຢືນຢັນວ່າ EcK2 ຍັງຟອສຟໍຣິເລດ 20E ໃນເພດຍິງ. ສິ່ງທີ່ໜ້າສັງເກດ, ເພດຍິງທີ່ບໍລິສຸດທີ່ຫຼຸດລົງຂອງ EcK2 ຍັງຄົງມີເພດສຳພັນຢ່າງເຕັມທີ່ (ຂໍ້ມູນຂະຫຍາຍ ຮູບທີ 5d,e), ຊີ້ບອກຕື່ມອີກວ່າການຜະລິດ 20E ຂອງເພດຍິງບໍ່ໄດ້ກະຕຸ້ນໄລຍະເວລາທີ່ທົນທານຕໍ່ການຫາຄູ່. ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ເພດຍິງເຫຼົ່ານີ້ມີ ອັດຕາການວາງໄຂ່ເພີ່ມຂຶ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍເມື່ອທຽບກັບກຸ່ມຄວບຄຸມ, ໂດຍມີຫຼາຍກວ່າ 30% ຂອງຜູ້ຍິງບໍລິສຸດວາງໄຂ່ (ຮູບທີ 5f). ຖ້າການສັກຢາ Eck2 RNA (dsEcK2) ແບບສາຍຄູ່ໄດ້ຖືກປະຕິບັດຫຼັງຈາກການກິນເລືອດ, ການວາງໄຂ່ບໍ່ໄດ້ເກີດຂຶ້ນ, ເຊິ່ງຈຸດສູງສຸດ 20E ເນື່ອງຈາກການກິນເລືອດໄດ້ຫຼຸດລົງ. ໂດຍລວມແລ້ວ, ຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້ສະໜັບສະໜູນຮູບແບບທີ່ 20E ທີ່ຜະລິດຫຼັງຈາກການດູດເລືອດສາມາດກະຕຸ້ນການວາງໄຂ່ໄດ້, ແຕ່ພຽງແຕ່ເມື່ອການສະກັດກັ້ນການວາງໄຂ່ (EcK2 ແລະອາດຈະເປັນປັດໄຈອື່ນໆ) ຖືກປິດໂດຍການຫາຄູ່. ທັງການສັກຢາ 20E ແລະ 3D20E ບໍ່ໄດ້ຍັບຍັ້ງການສະແດງອອກຂອງ EcK2 ໃນຜູ້ຍິງບໍລິສຸດ (ຮູບທີ 5g), ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າປັດໄຈອື່ນໆເປັນສື່ກາງໃນການຍັບຍັ້ງ kinase ນີ້. ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ລະດັບ 20E ຫຼັງຈາກການກິນເລືອດບໍ່ພຽງພໍທີ່ຈະກະຕຸ້ນຄວາມບໍ່ສະບາຍໃນການຫາຄູ່, ແຕ່ຖືກກະຕຸ້ນຢ່າງມີປະສິດທິພາບໂດຍ titers ສູງຂອງ 3D20E ທີ່ຖືກໂອນທາງເພດ.
ຜົນໄດ້ຮັບຂອງພວກເຮົາໃຫ້ຄວາມເຂົ້າໃຈທີ່ສຳຄັນກ່ຽວກັບກົນໄກທີ່ຄວບຄຸມຄວາມສຳເລັດໃນການສືບພັນຂອງ A. gambiae. ຮູບແບບໄດ້ເກີດຂຶ້ນບ່ອນທີ່ເພດຊາຍໄດ້ພັດທະນາເພື່ອສັງເຄາະ titers ສູງຂອງ 3D20E, ເຊິ່ງເປັນ ecdysone ທີ່ຖືກດັດແປງສະເພາະເພດຊາຍທີ່ຮັບປະກັນການເປັນພໍ່ແມ່ໂດຍການເຮັດໃຫ້ເພດຍິງບໍ່ມີຄວາມຮູ້ສຶກຕໍ່ການຫາຄູ່ຕື່ມອີກ. ໃນເວລາດຽວກັນ, ພາຫະນະໄຂ້ມາເລເຣຍເຫຼົ່ານີ້ຍັງໄດ້ພັດທະນາລະບົບທີ່ມີປະສິດທິພາບເພື່ອກະຕຸ້ນ 3D20E ໃນເພດຍິງເພື່ອຕອບສະໜອງຕໍ່ການໂອນຍ້າຍທາງເພດຂອງ EPP ສະເພາະເພດຊາຍ. ຕາມຄວາມຮູ້ຂອງພວກເຮົາ, ນີ້ແມ່ນຕົວຢ່າງທຳອິດຂອງລະບົບຮໍໂມນສະເຕີຣອຍທີ່ເພດຊາຍ ແລະ ເພດຍິງຄອບງຳທີ່ປະຕິບັດໜ້າທີ່ທີ່ເປັນເອກະລັກ ແລະ ສຳຄັນໃນແມງໄມ້. ໜ້າທີ່ ecdysone ສະເພາະເພດຊາຍໄດ້ຖືກສົມມຸດຕິຖານແຕ່ບໍ່ໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນຢ່າງແນ່ນອນ. ຕົວຢ່າງ, ສົມມຸດຕິຖານທີ່ຖືກພິສູດແລ້ວສ່ວນໃຫຍ່ 18 ແມ່ນວ່າໜ້າທີ່ເຫຼົ່ານີ້ອາດຈະຖືກປະຕິບັດໂດຍຕົວກ່ອນ 20E E1. ເປັນທີ່ຮູ້ກັນດີວ່າໃນ Drosophila, monandry ແມ່ນກະຕຸ້ນໂດຍການໂອນຍ້າຍທາງເພດຂອງ peptides ເພດຂະໜາດນ້ອຍ 19,20 ທີ່ພົວພັນກັບ neurons ທີ່ເຮັດໃຫ້ລະບົບສືບພັນເພດຍິງເປັນ innervating ຜ່ານຕົວຮັບ peptide ເພດສະເພາະ 21,22. ຕ້ອງມີວຽກງານຕື່ມອີກເພື່ອກຳນົດລຸ່ມ ສາຍນ້ຳສັນຍານທີ່ຄວບຄຸມໂດຍ 3D20E ໃນແມ່ພັນ A. gambiae ແລະ ເພື່ອກຳນົດວ່າສາຍນ້ຳເຫຼົ່ານີ້ສາມາດຖືກອະນຸລັກໄວ້ລະຫວ່າງຍຸງ ແລະ ນົກ Drosophila ໄດ້ຫຼືບໍ່.
ເນື່ອງຈາກບົດບາດສຳຄັນຂອງ 3D20E ຕໍ່ການຈະເລີນພັນ ແລະ ພຶດຕິກຳຂອງເພດຍິງທີ່ໄດ້ລະບຸໄວ້ໃນການສຶກສາຂອງພວກເຮົາ, ເສັ້ນທາງທີ່ນຳໄປສູ່ການສັງເຄາະ ແລະ ການກະຕຸ້ນ 3D20E ສະເໜີໂອກາດໃໝ່ສຳລັບຍຸດທະສາດການຄວບຄຸມຍຸງໃນອະນາຄົດ, ເຊັ່ນ: ການຜະລິດເຊື້ອຊາຍທີ່ເປັນໝັນໃນການແຂ່ງຂັນໃນຍຸດທະສາດເຕັກໂນໂລຢີແມງໄມ້ທີ່ເປັນໝັນ, ການນຳໃຊ້ເພື່ອການປ່ອຍຕົວແບບທຳມະຊາດ ຫຼື ເພື່ອຮຽນແບບ 3D20E ໃນການຫຼິ້ນແບບບໍລິສຸດ. ໜ້າທີ່ສະເພາະຂອງເພດຊາຍຂອງ 3D20E ອາດຈະໄດ້ພັດທະນາເມື່ອ A. gambiae ແລະ ຊະນິດ Cellia ອື່ນໆໄດ້ຮັບຄວາມສາມາດໃນການແຂງຕົວຂອງນໍ້າອະສຸຈິຂອງພວກມັນເຂົ້າໄປໃນປລັກປະສົມພັນ, ຍ້ອນວ່າສິ່ງນີ້ຊ່ວຍໃຫ້ການໂອນຮໍໂມນ ແລະ ເອນໄຊກະຕຸ້ນຮໍໂມນຈຳນວນຫຼວງຫຼາຍໄດ້ຢ່າງມີປະສິດທິພາບ. ໃນທາງກັບກັນ, ວິວັດທະນາການ 3D20E ທີ່ໃຊ້ monandry ໃຫ້ກົນໄກສຳລັບເພດຍິງ (ຜ່ານການສະແດງອອກສູງຂອງ MISO) ເພື່ອສະໜັບສະໜູນຄວາມແຂງແຮງຂອງການຈະເລີນພັນຂອງພວກມັນໃນເຂດທີ່ມີອັດຕາການແຜ່ລະບາດຂອງໄຂ້ຍຸງສູງ, ເຊິ່ງປະກອບສ່ວນທາງອ້ອມຕໍ່ການສົ່ງຕໍ່ Plasmodium. ເນື່ອງຈາກວ່າເພດຍິງ 20E ໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າມີຜົນກະທົບຢ່າງເລິກເຊິ່ງຕໍ່ການຢູ່ລອດ ແລະ ການເຕີບໂຕຂອງ P. falciparum ໃນຍຸງ Anopheles ເພດຍິງ,24 ທັງເສັ້ນທາງຮໍໂມນສະເຕີຣອຍເພດຊາຍ ແລະ ເພດຍິງໃນປັດຈຸບັນແມ່ນລັກສະນະສຳຄັນຂອງການພົວພັນລະຫວ່າງຍຸງກັບປາສິດ.
ເຊື້ອແບັກທີເຣັຍ A. gambiae G3 ໄດ້ຖືກລ້ຽງພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂມາດຕະຖານຂອງແມງໄມ້ (26-28 °C, ຄວາມຊຸ່ມຊື່ນສຳພັດ 65-80%, ໄລຍະເວລາແສງ 12:12 ຊົ່ວໂມງ ທີ່ມີແສງສະຫວ່າງ/ມືດ). ຕົວອ່ອນໄດ້ຖືກໃຫ້ອາຫານປາຜົງ (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets ແລະ Tetra Pond Sticks ໃນອັດຕາສ່ວນ 7:7:2). ຍຸງໂຕເຕັມໄວໄດ້ຮັບສານລະລາຍ dextrose 10% ແລະເລືອດຄົນປະຈຳອາທິດ (ສ່ວນປະກອບຂອງເລືອດໃນການສຶກສາ). ຍຸງເວີຈິນໄດ້ມາຈາກການແຍກເພດໃນໄລຍະດັກແມ່ຫຼັງຈາກກວດສອບປາຍດ້ວຍກ້ອງຈຸລະທັດ. ຕົວຜູ້ທີ່ມີ transgene DsRed ໄດ້ຖືກອະທິບາຍມາກ່ອນໜ້ານີ້.
ການທົດລອງການຫາຄູ່ແບບບັງຄັບໄດ້ຖືກປະຕິບັດຕາມໂປໂຕຄອນທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ກ່ອນໜ້ານີ້. ສຳລັບການຫາຄູ່ແບບທຳມະຊາດ, ຜູ້ຍິງບໍລິສຸດອາຍຸ 4 ມື້ໄດ້ຖືກເກັບຮັກສາໄວ້ໃນອັດຕາສ່ວນ 1:3 ກັບຜູ້ຊາຍບໍລິສຸດທີ່ເຕີບໃຫຍ່ເຕັມທີ່ເປັນເວລາສອງຄືນ. ສຳລັບການທົດລອງທີ່ຜູ້ຊາຍໄດ້ຮັບການສັກຢາ dsEPP, ການລ້ຽງຮ່ວມກັນສອດຄ່ອງກັບມື້ທີ 3-4 ຫຼັງຈາກການສັກຢາ, ເມື່ອກິດຈະກຳຂອງ phosphatase ຖືກງຽບລົງສູງສຸດ (ຮູບຂໍ້ມູນທີ່ຂະຫຍາຍອອກ 2b).
ເນື້ອເຍື່ອຍຸງ, ສົບທີ່ເຫຼືອ (ສ່ວນທີ່ເຫຼືອຂອງຮ່າງກາຍ), ຫຼື ຮ່າງກາຍທັງໝົດໄດ້ຖືກຜ່າຕັດເປັນເມທານອນ 100% ແລະ ເຮັດໃຫ້ເປັນເອກະພາບດ້ວຍເຄື່ອງປັ່ນ (ລູກປັດແກ້ວ 2 ມມ, 2,400 rpm, 90 ວິນາທີ). ປະລິມານເນື້ອເຍື່ອ ແລະ ປະລິມານເມທານອນມີດັ່ງນີ້: ສ່ວນທີ່ເຫຼືອຂອງຮ່າງກາຍ, 50 ໃນ 1,000 µl; MAG, 50–100 80 µl; LRT ເພດຍິງ, 25–50 80 µl. ຕະກອນໄດ້ຖືກສະກັດເອົາເມທານອນຄັ້ງທີສອງດ້ວຍປະລິມານເມທານອນດຽວກັນ. ຊາກຂອງຈຸລັງໄດ້ຖືກກຳຈັດອອກໂດຍການປั่นແຍກ. ເມທານອນຈາກການສະກັດທັງສອງຢ່າງໄດ້ຖືກລວມເຂົ້າກັນ ແລະ ເຮັດໃຫ້ແຫ້ງພາຍໃຕ້ກະແສໄນໂຕຣເຈນ, ຫຼັງຈາກນັ້ນຈຶ່ງລະລາຍຄືນໃໝ່ໃນປະລິມານເມທານອນ 80% ໃນນ້ຳຕໍ່ໄປນີ້: ສ່ວນທີ່ເຫຼືອຂອງຮ່າງກາຍ, 50 µl; MAGs ແລະ LRT ເພດຍິງ, 30 µl.
ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກວິເຄາະໃນເຄື່ອງວັດແທກມວນສານ (ID-X, Thermo Fisher) ທີ່ເຊື່ອມຕໍ່ກັບເຄື່ອງມື LC (Vanquish, Thermo Fisher). ຕົວຢ່າງ 5 µl ໄດ້ຖືກສີດໃສ່ຖັນຂະໜາດ 3 µm, 100 × 4.6 ມມ (Inspire C8, Dikma) ທີ່ຮັກສາໄວ້ທີ່ 25 °C. ໄລຍະເຄື່ອນທີ່ສຳລັບ LC ແມ່ນ A (ນ້ຳ, ກົດຟໍມິກ 0.1%) ແລະ B (acetonitrile, ກົດຟໍມິກ 0.1%). ການປ່ຽນແປງ LC ແມ່ນດັ່ງຕໍ່ໄປນີ້: 5% B ເປັນເວລາ 1 ນາທີ, ຈາກນັ້ນເພີ່ມຂຶ້ນເປັນ 100% B ໃນໄລຍະເວລາ 11 ນາທີ. ຫຼັງຈາກ 8 ນາທີທີ່ 100%, ໃຫ້ດຸ່ນດ່ຽງຖັນຄືນໃໝ່ທີ່ 5% B ເປັນເວລາ 4 ນາທີ. ອັດຕາການໄຫຼແມ່ນ 0.3 ml min-1. ການໄອອອນໄນເຊຊັນໃນແຫຼ່ງ MS ແມ່ນບັນລຸໄດ້ໂດຍການໄອອອນໄນເຊຊັນດ້ວຍໄຟຟ້າສະເປຣຍ໌ທີ່ມີຄວາມຮ້ອນໃນຮູບແບບບວກ ແລະ ລົບ.
ເຄື່ອງວັດແທກມວນສານວັດແທກຂໍ້ມູນໃນລະດັບ m/z ຕັ້ງແຕ່ 350 ຫາ 680 ທີ່ຄວາມລະອຽດ 60,000 ໃນຮູບແບບ MS ເຕັມຮູບແບບ. ຂໍ້ມູນ MS/MS ໄດ້ມາຈາກ [M + H]+ (ເປົ້າໝາຍທັງໝົດ), [M - H2O + H]+ (ເປົ້າໝາຍທັງໝົດ), ແລະ [M - H]- (ເປົ້າໝາຍທີ່ມີຟອສຟໍຣິເລດ). ຂໍ້ມູນ MS/MS ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອຢືນຢັນຄຸນສົມບັດຂອງ ecdysone ຂອງເປົ້າໝາຍທີ່ບໍ່ມີມາດຕະຖານ. ເພື່ອກໍານົດ ecdysteroids ທີ່ບໍ່ແມ່ນເປົ້າໝາຍ, ຂໍ້ມູນ MS/MS ສໍາລັບຈຸດສູງສຸດ HPLC ທັງໝົດທີ່ມີຄວາມອຸດົມສົມບູນທຽບເທົ່າ >15% ໄດ້ຖືກວິເຄາະ. ຄິດໄລ່ປະລິມານໂດຍໃຊ້ເສັ້ນໂຄ້ງມາດຕະຖານທີ່ສ້າງຂຶ້ນຈາກມາດຕະຖານບໍລິສຸດ (20E, 3D20E) ເພື່ອຄິດໄລ່ປະລິມານຢ່າງແທ້ຈິງ ຫຼື ການລະລາຍຂອງຕົວຢ່າງສະເພາະໜຶ່ງ (ເປົ້າໝາຍອື່ນໆທັງໝົດ) ເພື່ອຄິດໄລ່ຄວາມທຽບເທົ່າຂອງພວກມັນກັບປະລິມານທີ່ພົບໃນຜູ້ຊາຍໜຶ່ງຄົນ. ສໍາລັບ 3D20E, ການວັດແທກປະລິມານໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ຜົນບວກຂອງສານປະກອບຕໍ່ໄປນີ້: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. ຂໍ້ມູນໄດ້ຖືກສະກັດ ແລະ ວັດແທກໂດຍໃຊ້ Tracefinder (ລຸ້ນ 4.1). ຂໍ້ມູນ MS/MS ໄດ້ຖືກວິເຄາະໂດຍໃຊ້ Xcalibur (ລຸ້ນ 4.4). ສະເປກຕຣຳ MS ຂອງ E, 20E ແລະ 3D20E ໄດ້ຖືກປຽບທຽບກັບມາດຕະຖານທີ່ກ່ຽວຂ້ອງ. 3D20E22P ໄດ້ຖືກວິເຄາະໂດຍການອະນຸພັນດ້ວຍສານ Girard's reagent. 20E22P ໄດ້ຖືກວິເຄາະໂດຍອັດຕາສ່ວນ m/z.
3D20E22P ໄດ້ຖືກບໍລິສຸດຈາກ MAG. ການກັ່ນຕອງໄດ້ຖືກປະຕິບັດໃນລະດັບການວິເຄາະໂດຍໃຊ້ໂຄຣມາໂຕກຣາຟິກແຫຼວປະສິດທິພາບສູງ (Acquity, Waters) ດ້ວຍເຄື່ອງກວດຈັບມວນສານ quadrupole (QDa, Acquity, Waters) ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂ LC ດຽວກັນກັບການວິເຄາະ HPLC-MS/MS. ການເກັບກຳສ່ວນໄດ້ຖືກກະຕຸ້ນເມື່ອ m/z ທີ່ສອດຄ້ອງກັບ 3D20E22P ຖືກກວດພົບໃນເວລາຮັກສາໄວ້ດຽວກັນກັບທີ່ໄດ້ກຳນົດໄວ້ກ່ອນໜ້ານີ້. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ຄວາມບໍລິສຸດຂອງສານປະກອບທີ່ສະກັດອອກມາໄດ້ຖືກກວດສອບໂດຍ HPLC-MS/MS ຕາມທີ່ໄດ້ອະທິບາຍຂ້າງເທິງ.
RNA ທັງໝົດໄດ້ຖືກສະກັດຈາກເນື້ອເຍື່ອສືບພັນ 10-12 ຫຼືສ່ວນອື່ນໆຂອງຮ່າງກາຍ (ບໍ່ມີຫົວ) ໂດຍໃຊ້ TRI reagent (Thermo Fisher) ຕາມຄຳແນະນຳຂອງຜູ້ຜະລິດ. RNA ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ TURBO DNase (Thermo Fisher). cDNA ໄດ້ຖືກສັງເຄາະໂດຍໃຊ້ Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (M-MLV RT; Thermo Fisher) ຕາມຄຳແນະນຳຂອງຜູ້ຜະລິດ. ໄພຣເມີສຳລັບການຖອດລະຫັດແບບປີ້ນກັບກັນ PCR (RT-qPCR; Extended Data Table 2) ໄດ້ຖືກເຜີຍແຜ່ກ່ອນໜ້ານີ້24 ຫຼືອອກແບບໂດຍໃຊ້ Primer-BLAST26, ໂດຍມີຄວາມມັກໃຫ້ກັບຜະລິດຕະພັນທີ່ມີຂະໜາດ 70-150 bp ແລະ spanning exon-exon junctions ຫຼື ໄພຣເມີຄູ່ Primer ແຍກ exons. ຕົວຢ່າງ cDNA ຈາກສາມຫາສີ່ສຳເນົາທາງຊີວະພາບໄດ້ຖືກເຈືອຈາງສີ່ເທົ່າໃນນ້ຳສຳລັບ RT-qPCR. ການວັດແທກປະລິມານໄດ້ຖືກປະຕິບັດໃນປະຕິກິລິຍາຊ້ຳ 15 µl ທີ່ມີ 1 × PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), ໄພຣເມີ, ແລະ 5 µl ຂອງ cDNA ທີ່ເຈືອຈາງ. ປະຕິກິລິຍາໄດ້ຖືກດຳເນີນການໃນ ລະບົບ PCR ແບບເວລາຈິງ QuantStudio 6 Pro (Thermo Fisher) ແລະ ຂໍ້ມູນໄດ້ຖືກເກັບກຳ ແລະ ວິເຄາະໂດຍໃຊ້ການອອກແບບ ແລະ ການວິເຄາະ (ເວີຊັນ 2.4.3). ດັ່ງທີ່ສະແດງໃຫ້ເຫັນໃນການສຶກສານີ້, ປະລິມານທີ່ກ່ຽວຂ້ອງໄດ້ຖືກປັບໃຫ້ເປັນປົກກະຕິກັບ gene ribosomal RpL19 (AGAP004422), ເຊິ່ງການສະແດງອອກຂອງມັນບໍ່ປ່ຽນແປງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍດ້ວຍການໃຫ້ເລືອດ 27 ຫຼື ການຈັບຄູ່ 3.
ຄຸນນະພາບ RNA ໄດ້ຖືກກວດສອບໂດຍໃຊ້ເຄື່ອງວິເຄາະຊີວະພາບ Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent). ຫ້ອງສະໝຸດຄູ່ Illumina ໄດ້ຖືກກະກຽມ ແລະ ດຳເນີນການຢູ່ທີ່ສະຖາບັນ Broad ຂອງ MIT ແລະ Harvard. ການອ່ານລຳດັບໄດ້ຖືກຈັດລຽງກັບຈີໂນມ A. gambiae (ເຊື້ອ PEST, ລຸ້ນ 4.12) ໂດຍໃຊ້ HISAT2 (ລຸ້ນ 2.0.5) ດ້ວຍພາລາມິເຕີເລີ່ມຕົ້ນ. ການອ່ານທີ່ມີຄະແນນຄຸນນະພາບການສ້າງແຜນທີ່ (MAPQ) <30 ໄດ້ຖືກລຶບອອກໂດຍໃຊ້ Samtools (ລຸ້ນ 1.3.1). ຈຳນວນການອ່ານທີ່ແຜນທີ່ໄປຫາຍີນໄດ້ຖືກນັບໂດຍໃຊ້ htseq-count (ລຸ້ນ 0.9.1) ດ້ວຍພາລາມິເຕີເລີ່ມຕົ້ນ. ຈຳນວນການອ່ານທີ່ເປັນປົກກະຕິໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ ແລະ ການສະແດງອອກຂອງຍີນທີ່ແຕກຕ່າງກັນໄດ້ຖືກວິເຄາະໂດຍໃຊ້ຊຸດ DESeq2 (ລຸ້ນ 1.28.1) ໃນ R (ລຸ້ນ 4.0.3).
ຜູ້ສະໝັກທີ່ເປັນ gene ດັດແປງ Ecdysone ໄດ້ຖືກລະບຸໂດຍການຄົ້ນຫາ genome A. gambiae ກ່ອນໂດຍໃຊ້ອັລກໍຣິທຶມ PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), ໂດຍໃຊ້ຄ່າເລີ່ມຕົ້ນຂອງພາລາມິເຕີທີ່ມີລໍາດັບໂປຣຕີນຕໍ່ໄປນີ້: ຈາກ Bombyx mori (ເລກທີ່ເຂົ້າເຖິງ NP_001038956.1), Musca domestica (ເລກທີ່ເຂົ້າເຖິງ XP_005182020.1, XP_005175332.1 ແລະ XP_011294434.1) ແລະ Microplitis demolitor (ເລກທີ່ເຂົ້າເຖິງ XP_008552646.1 ແລະ XP_008552645.1) EcK ຈາກ B. mori (ເລກທີ່ເຂົ້າເຖິງ NP_001036900), Drosophila melanogaster (ເລກທີ່ເຂົ້າເຖິງ NP_651202), Apis mellifera (ເລກທີ່ເຂົ້າເຖິງ XP_394838) ແລະ Acyrthosiphon pisum (ເລກທີ່ເຂົ້າເຖິງ XP_001947166); ແລະ EPP ຈາກ B. mori (ເລກທີ່ເຂົ້າເຖິງ XP_001947166) NP_001177919.1 ແລະ NP_001243996.1) ແລະ EO ຂອງ D. melanogaster (ເລກທີ່ເຂົ້າເຖິງ NP_572986.1) (ຂັ້ນຕອນທີ 1). ຕໍ່ໄປ, ກັ່ນຕອງຜົນການສະແດງອອກຂອງ mRNA ສູງ (>100 ຊິ້ນສ່ວນ/kilobase exons ຕໍ່ລ້ານການອ່ານທີ່ແຜນທີ່ (FPKM) ຫຼື >85%) ໃນເນື້ອເຍື່ອສືບພັນ (LRT ຫຼື MAG ເພດຍິງ) ໃນປະເທດແກມເບຍ (ຂັ້ນຕອນທີ 2). ເພື່ອປັບປຸງຄວາມຈຳເພາະ, ພວກເຮົາໄດ້ເລືອກເອນໄຊມ໌ທີ່ສະແດງອອກໃນເນື້ອເຍື່ອສືບພັນຂອງ A. albimanus, ເຊິ່ງເປັນຊະນິດຂອງສັດປີກທີ່ບໍ່ມີການສັງເຄາະ ຫຼື ຖ່າຍໂອນ ecdysone ໃນລະຫວ່າງການຫາຄູ່. ເອນໄຊມ໌ທີ່ປາກົດໄດ້ຖືກກັ່ນຕອງໂດຍອີງໃສ່ການສະແດງອອກຕ່ຳ (<100 FPKM ຫຼື <85th percentile) ໃນເນື້ອເຍື່ອສືບພັນຂອງ A. albimanus (ຂັ້ນຕອນທີ 3). ໃນຖານະເປັນຕົວກອງສຸດທ້າຍ (ຂັ້ນຕອນທີ 4), ເອນໄຊມ໌ທີ່ປາກົດຕ້ອງຕອບສະໜອງຢ່າງໜ້ອຍໜຶ່ງຢ່າງຕໍ່ໄປນີ້: (1) ເພີ່ມຂຶ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍຫຼັງຈາກການຫາຄູ່ (P < 0.05) ອີງຕາມການວິເຄາະຂອງເອນໄຊມ໌ທີ່ສະແດງອອກແຕກຕ່າງກັນ ແລະ (2) ໃນເນື້ອເຍື່ອທີ່ບໍ່ມີການສືບພັນ (< 85 % ຫຼື <100 FPKM).
ພວກເຮົາໄດ້ດັດແປງວິທີການທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ກ່ອນໜ້ານີ້ 28,29,30 ເພື່ອໃຫ້ບັນລຸການຕິດສະຫຼາກໄອໂຊໂທບຂອງສິ່ງມີຊີວິດທັງໝົດ. ໂດຍຫຍໍ້, Saccharomyces cerevisiae ປະເພດ II (YSC2, Sigma) ແບບທຳມະຊາດໄດ້ຖືກທົດສອບໃນທາດໄນໂຕຣເຈນຂອງເຊື້ອລາ (BD Difco, DF0335) ທີ່ມີ (wt/vol) ນ້ຳຕານກລູໂຄສ 2% (G7528, Sigma), ບໍ່ມີກົດອະມິໂນ 1.7% ແລະ ແອມໂມນຽມຊັນເຟດ. ສື່ກາງການເພາະເລี้ยง) ແລະ ແອມໂມນຽມຊັນເຟດ 15N 5% (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) ເປັນແຫຼ່ງໄນໂຕຣເຈນດຽວ. ເຊື້ອລາໄດ້ຖືກຟື້ນຟູໂດຍການປั่นແຍກ ແລະ ຕົວອ່ອນຍຸງໄດ້ຖືກໃຫ້ອາຫານຕາມຄວາມຕ້ອງການຈົນກວ່າຈະເກີດເປັນດັກ. ເສີມດ້ວຍແປ້ງປາ (0.5 ມກ ຕໍ່ຕົວອ່ອນ 300 ໂຕ) ເພື່ອປ້ອງກັນການຕາຍໃນໄລຍະທີສີ່. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ມີພຽງແຕ່ເພດຍິງເທົ່ານັ້ນທີ່ຖືກນໍາໃຊ້ໃນການທົດລອງການຫາຄູ່ກັບເພດຊາຍທີ່ບໍ່ມີປ້າຍຊື່ເພື່ອວິເຄາະໂປຣຕີໂອມເພດຊາຍທີ່ຖືກໂອນໃນລະຫວ່າງການຫາຄູ່.
ປາເພດແມ່ທີ່ບໍລິສຸດອາຍຸ 4-6 ມື້ທີ່ຕິດປ້າຍ 15N ໄດ້ຖືກບັງຄັບໃຫ້ຫາຄູ່ກັບປາເພດຜູ້ທີ່ບໍ່ມີປ້າຍທີ່ມີອາຍຸເທົ່າກັນ. ການຫາຄູ່ທີ່ປະສົບຜົນສຳເລັດໄດ້ຮັບການຢືນຢັນໂດຍການກວດຫາປລັກຫາຄູ່ພາຍໃຕ້ກ້ອງຈຸລະທັດ epifluorescence. ທີ່ 3, 12, ແລະ 24 hpm, atria ຂອງປາເພດແມ່ທີ່ຫາຄູ່ 45-55 ໂຕໄດ້ຖືກຜ່າຕັດເຂົ້າໄປໃນບັຟເຟີ ammonium bicarbonate 50 µl (pH 7.8) ແລະປະສົມເຂົ້າກັນດ້ວຍເຄື່ອງບົດ. ສານປະສົມໄດ້ຖືກ centrifuge ແລະສ່ວນເທິງຂອງນ້ຳຕານປະສົມກັບ 50 µl ຂອງ 0.1% RapiGest (186001860, Waters) ໃນ 50 mM ammonium bicarbonate. ສ່ວນເທິງຂອງນ້ຳຕານ ແລະເມັດຈາກແຕ່ລະຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກແຊ່ແຂງໃສ່ນ້ຳກ້ອນແຫ້ງ ແລະສົ່ງຄືນໄປທີ່ຫ້ອງທົດລອງ MacCoss ທີ່ມະຫາວິທະຍາໄລ Washington, ບ່ອນທີ່ການກະກຽມຕົວຢ່າງສຳລັບ LC-MS/MS ໄດ້ສຳເລັດ. ລະລາຍເມັດຄືນໃໝ່ໃນ 50 µl ຂອງ 0.1% RapiGest ໃນ 50 mM ammonium. ໄບຄາບອນເນດ ແລະ ໂຊນິກໃນອ່າງນໍ້າ. ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງໂປຣຕີນຂອງເມັດ ແລະ ນໍ້າທີ່ໄຫຼອອກມາໄດ້ຖືກວັດແທກໂດຍການວິເຄາະ BCA, ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກຫຼຸດລົງດ້ວຍ 5 mM dithiothreitol (DTT; Sigma), alkylated ດ້ວຍ 15 mM iodoacetamide (Sigma) ແລະ ບົ່ມຢູ່ທີ່ 37 °C (1:0 50) ເປັນເວລາ 1 ຊົ່ວໂມງດ້ວຍອັດຕາສ່ວນ trypsinization: trypsin: substrate). RapiGest ໄດ້ຖືກລະລາຍໂດຍການເພີ່ມ 200 mM HCl, ຕາມດ້ວຍການບົ່ມຢູ່ທີ່ 37 °C ເປັນເວລາ 45 ນາທີ ແລະ centrifugation ທີ່ 14,000 rpm ເປັນເວລາ 10 ນາທີທີ່ 4 °C ເພື່ອເອົາສິ່ງເສດເຫຼືອອອກ. ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກລ້າງໂດຍການສະກັດເອົາແຂງສອງຮູບແບບ (ຕະຫຼັບ Oasis MCX, Waters) ແລະ ລະລາຍຄືນໃໝ່ໃນກົດ formic 0.1% ສຳລັບຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງໂປຣຕີນສຸດທ້າຍທີ່ 0.33 µg µl-1. ໂປຣຕີໂອມ MAG ທີ່ບໍ່ມີປ້າຍຊື່ໄດ້ຖືກວິເຄາະຄ້າຍຄືກັນຈາກເພດຊາຍທີ່ບໍລິສຸດ. ສອງສຳເນົາການວິເຄາະ ໄດ້ຖືກວິເຄາະສຳລັບແຕ່ລະຕົວຢ່າງ. ຕໍ່ໄປ, 1 µg ຂອງແຕ່ລະອັນໄດ້ຖືກວິເຄາະໂດຍໃຊ້ຖັນ fused silica ຂະໜາດ 25 ຊມ ຂະໜາດ 75-μm ພ້ອມດ້ວຍ frit trap Kasil1 (PQ) ຂະໜາດ 4 ຊມ ທີ່ບັນຈຸດ້ວຍ Jupiter C12 reversed-phase resin (Phenomenex) ແລະ ໂຄຣມາໂຕກຣາຟີຂອງແຫຼວ 180 ນາທີ. ຕົວຢ່າງການຍ່ອຍ - MS/MS ໄດ້ຖືກດໍາເນີນການໃນເຄື່ອງວັດແທກມວນສານ Q-Exactive HF (Thermo Fisher) ດ້ວຍລະບົບ nanoACQUITY UPLC (Waters). ຂໍ້ມູນການໄດ້ມາທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບຂໍ້ມູນທີ່ເກີດຂຶ້ນສໍາລັບແຕ່ລະການດໍາເນີນການໄດ້ຖືກປ່ຽນເປັນຮູບແບບ mzML ໂດຍໃຊ້ Proteowizard (ເວີຊັນ 3.0.20287) ແລະ ການໃຊ້ Comet31 (ເວີຊັນ 3.2) ທຽບກັບຖານຂໍ້ມູນ FASTA ທີ່ມີລໍາດັບໂປຣຕີນຈາກ Anopheles gambiae (VectorBase ເວີຊັນ 54), Anopheles coluzzi. ການຄົ້ນຫາໄດ້ຖືກດໍາເນີນໃນ Mali-NIH (VectorBase ເວີຊັນ 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, ເດືອນມີນາ 2021), A. gambiae RNA-seq, ແລະ ການແປສາມເຟຣມຂອງສານປົນເປື້ອນຂອງມະນຸດທີ່ຮູ້ຈັກ. FDRs ທີ່ກົງກັບແຜນທີ່ peptide ໄດ້ຖືກກໍານົດໂດຍໃຊ້ Percolator32 (ເວີຊັນ 3.05) ດ້ວຍຂອບເຂດ 0.01, ແລະ peptides ໄດ້ຖືກປະກອບເຂົ້າກັນເປັນການລະບຸໂປຣຕີນໂດຍໃຊ້ protein parsimony ໃນ Limelight33 (ເວີຊັນ 2.2.0). ຄວາມອຸດົມສົມບູນຂອງໂປຣຕີນທຽບເທົ່າໄດ້ຖືກປະເມີນໂດຍໃຊ້ຕົວຄູນຄວາມອຸດົມສົມບູນທາງສະເປກຕຣຳທີ່ປົກກະຕິ (NSAF) ທີ່ຄິດໄລ່ສຳລັບແຕ່ລະໂປຣຕີນໃນແຕ່ລະການແລ່ນຕາມທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ກ່ອນໜ້ານີ້. NSAF ທຽບກັບແຕ່ລະໂປຣຕີນໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ໂດຍສະເລ່ຍໃນທົ່ວຕົວຢ່າງຈາກສອງສຳເນົາທາງຊີວະວິທະຍາທີ່ແຕກຕ່າງກັນ. ການຕິດສະຫຼາກ 15N ໄດ້ປິດບັງໂປຣຕີໂອມເພດຍິງໄດ້ສຳເລັດ, ເຖິງແມ່ນວ່າສາມາດກວດພົບໂປຣຕີນທີ່ບໍ່ມີສະເປກຕຣຳຈຳນວນໜ້ອຍຈາກເຊື້ອພັນບໍລິສຸດທີ່ຕິດສະຫຼາກ. ພວກເຮົາໄດ້ບັນທຶກການກວດພົບການຫຼຸດຜ່ອນໂປຣຕີນເພດຊາຍ (1-5 ສະເປກຕຣຳ) ໃນຕົວຢ່າງດິບເພດຍິງພຽງແຕ່ໃນການແລ່ນດ້ານວິຊາການ, ບ່ອນທີ່ຕົວຢ່າງດິບໄດ້ຖືກແລ່ນຫຼັງຈາກຕົວຢ່າງເພດຊາຍ/ການຫາຄູ່, ເປັນຜົນມາຈາກ HPLC “ຖືກນຳມາ”. ໂປຣຕີນບາງຄັ້ງທີ່ພົບເປັນ 'ສານປົນເປື້ອນ' ຈາກເຊື້ອພັນບໍລິສຸດທີ່ຕິດສະຫຼາກແມ່ນລະບຸໄວ້ໃນຕາຕະລາງເສີມ 1.
ສອງ peptides antigenic, QTTDRVAPAPDQQQ (ພາຍໃນ isotype PA) ແລະ MESDGTTPSGDSEQ (ພາຍໃນ isotype PA ແລະ PB) ໃນ Genscript. peptides ທັງສອງໄດ້ຖືກລວມເຂົ້າກັນ, ຫຼັງຈາກນັ້ນເຊື່ອມຕໍ່ກັບໂປຣຕີນຕົວນຳ KLH ແລະສັກເຂົ້າໄປໃນກະຕ່າຍນິວຊີແລນ. ກະຕ່າຍໄດ້ຖືກຂ້າຫຼັງຈາກການສັກຄັ້ງທີສີ່, ແລະ IgG ທັງໝົດໄດ້ຖືກແຍກອອກໂດຍການກັ່ນຕອງ affinity. IgG ຈາກກະຕ່າຍທີ່ຈຳເພາະ EPP ທີ່ສຸດໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການ Western blotting ຕື່ມອີກ.
ສຳລັບ Western blots, MAG (n = 10, ບ່ອນທີ່ n ໝາຍເຖິງຈຳນວນຕົວຢ່າງຍຸງທີ່ເປັນເອກະລາດທາງຊີວະພາບ) ແລະ LRT ເພດແມ່ (n = 30) ຈາກຍຸງເພດຜູ້ບໍລິສຸດອາຍຸ 4 ມື້ ແລະ ຍຸງເພດແມ່ທີ່ບໍລິສຸດ ຫຼື ຖືກບັງຄັບໃຫ້ປະສົມພັນ (<10 ຫຼັງການປະສົມພັນ), ສານສະກັດໂປຣຕີນ (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% sodium deoxycholate; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1 × protease inhibitor cocktail (Roche)) ໄດ້ຖືກເພີ່ມແຍກຕ່າງຫາກ. ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກປະສົມເຂົ້າກັນທັນທີຫຼັງຈາກການຜ່າຕັດດ້ວຍ beader (ລູກປັດແກ້ວ 2 ມມ, 2,400 rpm, 90 ວິນາທີ). ເສດເຫຼືອທີ່ບໍ່ລະລາຍໄດ້ຖືກກຳຈັດອອກໂດຍການ centrifugation ທີ່ 20,000 g ທີ່ 4 °C. ໂປຣຕີນໄດ້ຖືກວັດແທກປະລິມານໂດຍ Bradford assay (Bio-Rad). ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ໂປຣຕີນ MAG 20 µg, ໂປຣຕີນ LRT 40 µg, ແລະ ໂປຣຕີນຈຳນວນຫຼາຍທີ່ເຫຼືອ 20 µg ໄດ້ຖືກ ຖືກແຍກສະພາບ ແລະ ແຍກອອກດ້ວຍ 10% Bis-Tris NuPAGE ໂດຍໃຊ້ບັຟເຟີ MOPS. ໂປຣຕີນໄດ້ຖືກໂອນໄປຫາເຍື່ອ polyvinylidene fluoride ໂດຍໃຊ້ລະບົບການໂອນ iBlot2 (Thermo Fisher). ເຍື່ອໄດ້ຖືກລ້າງສອງຄັ້ງໃນ 1 × PBS-T (0.1% Tween-20 ໃນ PBS) ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນຖືກບລັອກໃນບັຟເຟີ Odyssey blocking (Li-Cor) ເປັນເວລາ 1 ຊົ່ວໂມງທີ່ 22°C. ເຍື່ອໄດ້ຖືກສັ່ນຄືນທີ່ 4°C ດ້ວຍພູມຕ້ານທານປະຖົມ polyclonal ຕ້ານ EPP ຂອງກະຕ່າຍທີ່ກຳນົດເອງ (1:700 ໃນບັຟເຟີ blocking) ແລະ ພູມຕ້ານທານປະຖົມ monoclonal ຕ້ານ actin ຂອງໜູ MAC237 (Abeam; 1:4,000). ເຍື່ອໄດ້ຖືກລ້າງດ້ວຍ PBS-T ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນບົ່ມເຊື້ອດ້ວຍພູມຕ້ານທານຂັ້ນສອງ (donkey anti-rabbit 800CW ແລະ goat anti-rat 680LT (Li-Cor), ທັງສອງ 1:20,000) ໃນບັຟເຟີ blocking ທີ່ມີ 0.01% SDS ແລະ 0.2% Tween -20. ເປັນເວລາ 1 ຊົ່ວໂມງທີ່ອຸນຫະພູມ 22 °C. ເຍື່ອຫຸ້ມໄດ້ຖືກລ້າງດ້ວຍ PBS-T ແລະຖ່າຍພາບດ້ວຍເຄື່ອງສະແກນ Odyssey CLx. ຮູບພາບໄດ້ຖືກເກັບກຳ ແລະປະມວນຜົນໃນ Image Studio (ເວີຊັນ 5.2). ບໍ່ກວດພົບແຖບສະເພາະທີ່ສອດຄ້ອງກັບ isoform EPP-RA (82 kDa).
ພາກພື້ນລະຫັດຂອງ EPP (ເປັນ isoform AGAP002463-RB ທີ່ມີໂດເມນ histidine phosphatase, ການຄົ້ນຫາໂດເມນທີ່ອະນຸລັກ NCBI 34) ແລະ EcK2 (AGAP002181) ໄດ້ຖືກໂຄນເຂົ້າໄປໃນ plasmid pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma); ໄພຣເມີໄດ້ຖືກລະບຸໄວ້ໃນຕາຕະລາງຂໍ້ມູນທີ່ຂະຫຍາຍອອກ 2. ຕົວເຊື່ອມຕໍ່ GS4 ແປດຕົວ (ຮ່ວມກັນ) ໄດ້ຖືກໃສ່ກ່ອນປ້າຍ C-terminal 6xHis ຂອງໂຄງສ້າງ pET-21a(+)-EcK2. ໂປຣຕີນ recombinant ໄດ້ຖືກຜະລິດໂດຍໃຊ້ປະຕິກິລິຍາສັງເຄາະໂປຣຕີນ E. coli ທີ່ບໍ່ມີຈຸລັງ NEBExpress (New England BioLabs). ໂປຣຕີນ recombinant ໄດ້ຖືກບໍລິສຸດໂດຍໃຊ້ຖັນໝຸນ NEBExpress Ni (New England BioLabs). ໂປຣຕີນຄວບຄຸມ Dihydrofolate reductase (DHFR) ໄດ້ຖືກຜະລິດໂດຍໃຊ້ແມ່ແບບ DNA ຈາກຊຸດສັງເຄາະໂປຣຕີນ E. coli ທີ່ບໍ່ມີຈຸລັງ NEBExpress. ໂປຣຕີນໄດ້ຖືກເກັບຮັກສາໄວ້ໃນ glycerol 50% ໃນ PBS ທີ່ -20 °C ເປັນເວລາສູງສຸດ 3 ເດືອນ.
ກິດຈະກຳ Phosphatase ຂອງ EPP ແລະສານສະກັດຈາກເນື້ອເຍື່ອໄດ້ຖືກວັດແທກໂດຍໃຊ້ 4-nitrophenyl phosphate (pNPP; Sigma-Aldrich). ບັຟເຟີປະຕິກິລິຍາປະກອບດ້ວຍ 25 mM Tris, 50 mM ກົດອະເຊຕິກ, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, ແລະ 1 mM DTT. ເນື້ອເຍື່ອໄດ້ຖືກປະສົມເຂົ້າກັນໃນບັຟເຟີປະຕິກິລິຍາ ແລະ ເສດເຫຼືອຂອງຈຸລັງໄດ້ຖືກກຳຈັດອອກໂດຍການປั่นແຍກ. ເລີ່ມປະຕິກິລິຍາໂດຍການເພີ່ມ enzyme ຫຼື ສານສະກັດຈາກເນື້ອເຍື່ອໃສ່ບັຟເຟີປະຕິກິລິຍາທີ່ມີ 2.5 mg ml-1 pNPP. ສ່ວນປະສົມປະຕິກິລິຍາໄດ້ຖືກບົ່ມຢູ່ທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງໃນຄວາມມືດ, ແລະ ປະລິມານຂອງ pNP ທີ່ປ່ຽນຈາກ pNPP ໄດ້ຖືກວັດແທກໂດຍການວັດແທກການດູດຊຶມທີ່ 405 nm ໃນເວລາຕ່າງໆ.
ສຳລັບກິດຈະກຳ EcK ໃນຫຼອດທົດລອງ, ໂປຣຕີນໄດ້ຖືກບົ່ມດ້ວຍ 0.2 mg 20E ຫຼື 3D20E ໃນບັຟເຟີ 200 µl (pH 7.5) ທີ່ມີ 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP ແລະ 10 mM MgCl2 ເປັນເວລາ 2 ຊົ່ວໂມງທີ່ອຸນຫະພູມ 27°C. ປະຕິກິລິຍາໄດ້ຖືກຢຸດໂດຍການເພີ່ມເມທານອນ 800 µl, ຈາກນັ້ນເຮັດໃຫ້ເຢັນທີ່ -20°C ເປັນເວລາ 1 ຊົ່ວໂມງ, ຈາກນັ້ນປั่นແຍກທີ່ 20,000 g ເປັນເວລາ 10 ນາທີທີ່ອຸນຫະພູມ 4°C. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ສານລະລາຍເທິງໜ້ານ້ຳໄດ້ຖືກວິເຄາະໂດຍ HPLC-MS/MS. ເພື່ອຢຸດໂປຣຕີນທີ່ໃຊ້ໃນກຸ່ມຄວບຄຸມດ້ວຍຄວາມຮ້ອນ, ໂປຣຕີນໄດ້ຖືກບົ່ມໃນ glycerol 50% ໃນ PBS ເປັນເວລາ 20 ນາທີທີ່ອຸນຫະພູມ 95°C.
ສຳລັບກິດຈະກຳ EPP ໃນຫຼອດທົດລອງ, ໂປຣຕີນໄດ້ຖືກບົ່ມດ້ວຍ 3D20E22P (ເທົ່າກັບປະລິມານທີ່ພົບໃນ 18 ຄູ່ຂອງ MAG, ເຊິ່ງຖືກບໍລິສຸດໂດຍ HPLC-MS/MS) ໃນບັຟເຟີ 100 µl (pH 7.5) ທີ່ມີ 25 mM Tris, 50 mM ກົດອະຊິຕິກ, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, ແລະ 1 mM DTT ເປັນເວລາ 3 ຊົ່ວໂມງທີ່ອຸນຫະພູມ 27 °C. ປະຕິກິລິຍາໄດ້ຖືກຢຸດໂດຍການເພີ່ມເມທານອນ 400 µl ແລະເຮັດໃຫ້ເຢັນລົງທີ່ -20 °C ເປັນເວລາ 1 ຊົ່ວໂມງ, ຫຼັງຈາກນັ້ນປั่นແຍກທີ່ 20,000 g ເປັນເວລາ 10 ນາທີທີ່ອຸນຫະພູມ 4 °C. ນ້ຳໃຕ້ຜິວໄດ້ຖືກວິເຄາະໂດຍ HPLC-MS/MS.
ຊິ້ນສ່ວນ PCR ສຳລັບ EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) ແລະ EcK2 (556 bp) ໄດ້ຖືກຂະຫຍາຍຈາກ cDNA ທີ່ກະກຽມຈາກສົບຍຸງບໍ່ມີຫົວເພດປະສົມ. ຊິ້ນສ່ວນ PCR ຂອງ eGFP ກຸ່ມຄວບຄຸມ (495 bp) ໄດ້ຖືກຂະຫຍາຍຈາກ pCR2.1-eGFP ທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ກ່ອນໜ້ານີ້; ໄພຣເມີ PCR ໄດ້ຖືກລະບຸໄວ້ໃນຕາຕະລາງຂໍ້ມູນທີ່ຂະຫຍາຍອອກ 2. ຊິ້ນສ່ວນ PCR ໄດ້ຖືກໃສ່ລະຫວ່າງໂປຣໂມເຕີ T7 ທີ່ປີ້ນກັບກັນໃນພລາສມິດ pL4440. ໂຄງສ້າງພລາສມິດໄດ້ຖືກກູ້ຄືນຈາກ E. coli ທີ່ມີຄວາມສາມາດ NEB 5-α (New England Biolabs) ແລະ ກວດສອບໂດຍການຈັດລໍາດັບ DNA ກ່ອນການນໍາໃຊ້ (ເບິ່ງຂໍ້ມູນເພີ່ມເຕີມ 1 ສໍາລັບລໍາດັບການໃສ່). ໄພຣເມີທີ່ກົງກັບໂປຣໂມເຕີ T7 (ຕາຕະລາງຂໍ້ມູນທີ່ຂະຫຍາຍອອກ 2) ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອຂະຫຍາຍການໃສ່ຈາກພລາສມິດທີ່ອີງໃສ່ pL4440. ຂະໜາດຜະລິດຕະພັນ PCR ໄດ້ຖືກຢືນຢັນໂດຍ electrophoresis gel agarose. dsRNA ໄດ້ຖືກຄັດລອກຈາກແມ່ແບບ PCR ໂດຍໃຊ້ຊຸດ Megascript T7 Transcription Kit (Thermo Fisher) ແລະ ບໍລິສຸດຕາມຄໍາແນະນໍາຂອງຜູ້ຜະລິດດ້ວຍການດັດແປງທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ກ່ອນໜ້ານີ້.
ສຳລັບການສັກຢາ dsRNA, 1,380 ng ຂອງ dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) ໄດ້ຖືກສັກໃນຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ 10 ng nl-1 ເຂົ້າໄປໃນຊ່ອງເອິກຂອງຜູ້ໃຫຍ່ເພດຊາຍ ຫຼື ເພດຍິງ (Nanoject III, Drummond) ພາຍໃນ 1 ມື້ຫຼັງຈາກການປິດລ້ອມ. ລະດັບການລົ້ມເຫຼວຂອງ gene ໄດ້ຖືກກຳນົດໃນຢ່າງໜ້ອຍສາມສຳເນົາທາງຊີວະພາບໂດຍການສະກັດ RNA, ການສັງເຄາະ cDNA, ແລະ RT-qPCR. ສຳລັບການສັກຢາ ecdysone, ເພດຍິງທີ່ບໍລິສຸດອາຍຸ 4 ມື້ ຫຼື ເພດຍິງທີ່ລ້ຽງດ້ວຍເລືອດບໍລິສຸດອາຍຸ 6 ມື້ ໄດ້ຖືກສັກດ້ວຍ 0.13, 0.21, ຫຼື 0.63 µg ຂອງ 20E ຫຼື 3D20E (Nanoject III, Drummond) ໃນຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ 1.3, 2.1, ຕາມລຳດັບ, ຂຶ້ນກັບການອອກແບບການທົດລອງ ຫຼື 6.3 ng nl-1. ສັກ 100 nl ຂອງເອທານອນ 10% (vol/vol) ໃນນ້ຳ; 100 nl ຂອງ 3D20E22P ໃນເອທານອນ 10% (ເທົ່າກັບ 75% ຂອງປະລິມານທີ່ພົບໃນຄູ່ຂອງ MAGs). ຍຸງໄດ້ຖືກແບ່ງແບບສຸ່ມໃຫ້ກັບກຸ່ມສັກຢາ.
ສຳລັບການກວດສອບການວາງໄຂ່, ແມ່ຍຸງອາຍຸ 3 ມື້ໄດ້ຮັບເລືອດຂອງມະນຸດຕາມຄວາມຕ້ອງການ. ກຳຈັດຍຸງທີ່ກິນເລືອດບາງສ່ວນ ຫຼື ບໍ່ໄດ້ກິນ. ຂຶ້ນກັບການປິ່ນປົວ, ແມ່ຍຸງໄດ້ຖືກວາງໄວ້ໃນຈອກວາງໄຂ່ແຍກຕ່າງຫາກເປັນເວລາສີ່ຄືນຢ່າງໜ້ອຍ 48 ຊົ່ວໂມງຫຼັງຈາກກິນເລືອດ. ໄຂ່ໄດ້ຖືກນັບພາຍໃຕ້ເຄື່ອງສະແກນສະເຕີລິໂອສະໂຄບ (Stemi 508, Zeiss); ສຳລັບແມ່ຍຸງທີ່ຫາຄູ່ແລ້ວ, ໄຂ່ທີ່ຟັກອອກມາເປັນຕົວອ່ອນຖືກຖືວ່າອຸດົມສົມບູນ.
ສຳລັບການທົດລອງການຫາຄູ່, ເພດຍິງໄດ້ຮັບອະນຸຍາດໃຫ້ຢູ່ຢ່າງໜ້ອຍ 2 ມື້ຂຶ້ນກັບການປິ່ນປົວເພື່ອພັດທະນາຄວາມຕ້ານທານຕໍ່ການຫາຄູ່, ແລະ ເພດຊາຍທີ່ມີອາຍຸເທົ່າກັນກັບທຳມະຊາດໄດ້ຖືກນຳເຂົ້າໄປໃນກະຕ່າດຽວກັນ. ສອງຄືນຕໍ່ມາ, ຖົງນ້ຳທີ່ປະສົມພັນແລ້ວຂອງເພດຍິງໄດ້ຖືກຜ່າຕັດ ແລະ DNA ຈີໂນມໄດ້ຖືກປ່ອຍອອກມາໂດຍການແຊ່ແຂງ-ລະລາຍ ແລະ ການໃຊ້ສຽງໃນບັຟເຟີທີ່ມີ 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, ແລະ 25 mM NaCl (pH 8.2). ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກບົ່ມດ້ວຍ Proteinase K (0.86 µg µl-1) ເປັນເວລາ 15 ນາທີທີ່ 55 °C, ຕາມດ້ວຍ 10 ນາທີທີ່ 95 °C. ການກະກຽມ DNA ຈີໂນມດິບໄດ້ຖືກລະລາຍ 10 ເທົ່າ ແລະ ໄດ້ຮັບການກວດພົບ qPCR ຂອງລຳດັບໂຄໂມໂຊມ Y; ໄພຣເມີໄດ້ຖືກລະບຸໄວ້ໃນຕາຕະລາງຂໍ້ມູນທີ່ຂະຫຍາຍອອກ 2. ການບໍ່ມີລຳດັບໂຄໂມໂຊມ Y ຊີ້ບອກວ່າບໍ່ມີການຫາຄູ່.
ສຳລັບການກວດສອບການປະສົມພັນຄືນໃໝ່, ເພດຍິງທີ່ຖືກບັງຄັບໃຫ້ປະສົມພັນໄດ້ຖືກກວດສອບວ່າມີປລັກປະສົມພັນເພື່ອຢືນຢັນສະຖານະການປະສົມພັນ ແລະ ປ່ອຍໃຫ້ 2 ມື້ເພື່ອພັດທະນາການຕ້ານທານຕໍ່ການປະສົມພັນໃນເວລາທີ່ບໍ່ມີເພດຊາຍ, ດັ່ງທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ກ່ອນໜ້ານີ້ 36. ເພດຊາຍທີ່ມີອະສຸຈິດັດແປງພັນທຸກໍາ DsRed ໄດ້ຖືກນໍາເຂົ້າໄປໃນຄອກເພດຍິງ. ສອງຄືນຕໍ່ມາ, ຖົງນໍ້າອະສຸຈິທີ່ປະສົມພັນໄດ້ຖືກຜ່າຕັດອອກຈາກເພດຍິງ, ແລະ DNA genomic ໄດ້ຖືກກະກຽມຕາມທີ່ໄດ້ອະທິບາຍຂ້າງເທິງ ແລະ ໄດ້ຮັບການກວດພົບ qPCR ຂອງ transgene DsRed; ໄພຣເມີໄດ້ຖືກລະບຸໄວ້ໃນຕາຕະລາງຂໍ້ມູນທີ່ຂະຫຍາຍອອກ 2. ການບໍ່ມີ transgene DsRed ຊີ້ບອກວ່າບໍ່ມີການປະສົມພັນຄືນໃໝ່ເກີດຂຶ້ນ.
3D20E ໄດ້ຖືກສັງເຄາະຕາມທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ກ່ອນໜ້ານີ້ 37. ໂດຍຫຍໍ້, 10 ມກ ຂອງ 20E (Sigma-Aldrich) ໄດ້ຖືກລະລາຍໃນນໍ້າ 10 ມລ, ຕາມດ້ວຍການເພີ່ມ platinum black 30 ມກ (ໃນຮູບແບບຜົງ, Sigma-Aldrich). ກະແສ O2 ອ່ອນໆໄດ້ຖືກຟອງຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງເຂົ້າໄປໃນສ່ວນປະສົມປະຕິກິລິຍາ, ເຊິ່ງໄດ້ຖືກຄົນຢູ່ທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງ. ຫຼັງຈາກ 6 ຊົ່ວໂມງ, 30 ມລ ຂອງ methanol ໄດ້ຖືກເພີ່ມເຂົ້າໄປເພື່ອຢຸດປະຕິກິລິຍາ. ສ່ວນປະສົມດັ່ງກ່າວໄດ້ຖືກປั่นແຍກເພື່ອເອົາອະນຸພາກຕົວເລັ່ງປະຕິກິລິຍາອອກ. ສ່ວນທີ່ເປັນນ້ຳຕານໄດ້ຖືກລະເຫີຍຈົນແຫ້ງໃນສູນຍາກາດທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງ. ຜະລິດຕະພັນປະຕິກິລິຍາແຫ້ງໄດ້ຖືກລະລາຍໃນ 10% ethanol ແລະ methanol ສໍາລັບການສີດສໍາລັບການວິເຄາະ HPLC-MS/MS. ອັດຕາການປ່ຽນແປງ (ຈາກ 20E ຫາ 3D20E) ແມ່ນປະມານ 97% (ຮູບທີ 4b), ແລະສະເປກຕຣຳ MS ຂອງ 3D20E ທີ່ສັງເຄາະໄດ້ກົງກັບທີ່ພົບໃນເພດຍິງທີ່ຫາຄູ່ (ຮູບທີ 4c).
ຄຳອະທິບາຍປະກອບມີລາຍລະອຽດສະເພາະຂອງການທົດສອບທາງສະຖິຕິທີ່ໄດ້ປະຕິບັດ.GraphPad (ລຸ້ນ 9.0) ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອປະຕິບັດການທົດສອບ Fisher's exact, ການທົດສອບ Mantel-Cox, ແລະການທົດສອບ t ຂອງນັກຮຽນ. ການທົດສອບ Cochran-Mantel-Haenszel ໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ສະຄຣິບ R ທີ່ກຳນົດເອງ (ມີຢູ່ໃນ https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). ການແຈກຢາຍຂໍ້ມູນໄດ້ຖືກທົດສອບສໍາລັບຄວາມເປັນປົກກະຕິໂດຍໃຊ້ການທົດສອບ Shapiro-Wilk ດ້ວຍຂອບເຂດຄວາມສໍາຄັນ 0.05. ເມື່ອຂໍ້ມູນລົ້ມເຫຼວໃນການທົດສອບຄວາມເປັນປົກກະຕິ, ການທົດສອບ Mann-Whitney ໄດ້ຖືກປະຕິບັດ. ຂໍ້ມູນການຢູ່ລອດໄດ້ຖືກວິເຄາະໂດຍໃຊ້ການທົດສອບ Mantel-Cox.ຊຸດ DESeq2 (ລຸ້ນ 1.28.1) ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອປະຕິບັດການວິເຄາະການສະແດງອອກທີ່ແຕກຕ່າງກັນລະດັບ gene RNA-seq.ແຖບນອນໃນກຣາຟສະແດງເຖິງຄ່າກາງ.ຄ່າຄວາມສໍາຄັນຂອງ P = 0.05 ຖືກນໍາໃຊ້ເປັນຂອບເຂດສໍາລັບການທົດສອບທັງໝົດ.
ສຳລັບຂໍ້ມູນເພີ່ມເຕີມກ່ຽວກັບແບບການສຶກສາ, ເບິ່ງບົດຄັດຫຍໍ້ຂອງບົດລາຍງານການຄົ້ນຄວ້າທຳມະຊາດທີ່ເຊື່ອມໂຍງກັບບົດຄວາມນີ້.
ຂໍ້ມູນໂປຣຕີໂອມິກຂອງ MS ໄດ້ຖືກຝາກໄວ້ໃນ ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) ຜ່ານ PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) ດ້ວຍຕົວລະບຸຊຸດຂໍ້ມູນ PXD032157.
ຊຸດຂໍ້ມູນ RNA-seq ຖືກເກັບຮັກສາໄວ້ໃນຫໍສະໝຸດ Gene Expression Comprehensive Library (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) ພາຍໃຕ້ບັນທຶກລຳດັບ GSE198665.
ຊຸດຂໍ້ມູນເພີ່ມເຕີມທີ່ສ້າງຂຶ້ນ ແລະ/ຫຼື ວິເຄາະໃນລະຫວ່າງການສຶກສາໃນປະຈຸບັນອາດຈະໄດ້ຮັບຈາກຜູ້ຂຽນທີ່ສອດຄ້ອງກັນຕາມການຮ້ອງຂໍທີ່ສົມເຫດສົມຜົນ. ບົດຄວາມນີ້ໃຫ້ຂໍ້ມູນແຫຼ່ງຂໍ້ມູນ.
De Loof, A. Ecdysteroids: ຢາສະເຕີຣອຍເພດຂອງແມງໄມ້ທີ່ຖືກລະເລີຍ? ເພດຜູ້: Black Box.Insect Science.13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hydroxyecdysone ແລະ ການພັດທະນາຮວຍໄຂ່ໃນ Anopheles stephens.J. Insect Physiology.28, 97–109 (1982).