ການຈັດຮຽງໂປຣຕີນໃນເສັ້ນທາງການຫຼั่งແມ່ນສິ່ງຈຳເປັນສຳລັບການຮັກສາການແບ່ງສ່ວນຂອງເຊວ ແລະ ສະພາບສົມດຸນຂອງເຊວ. ນອກເໜືອໄປຈາກການຈັດຮຽງທີ່ໄກ່ເກ່ຍໂດຍເປືອກ, ບົດບາດຂອງໄຂມັນໃນການຈັດຮຽງ kinesin ໃນຂະບວນການຂົນສົ່ງການຫຼั่งແມ່ນຄຳຖາມພື້ນຖານທີ່ມີມາດົນແລ້ວທີ່ຍັງບໍ່ທັນໄດ້ຮັບຄຳຕອບ. ໃນທີ່ນີ້, ພວກເຮົາປະຕິບັດການຖ່າຍພາບ 3D ພ້ອມໆກັນທີ່ມີຄວາມລະອຽດສູງຫຼາຍສີພ້ອມໆກັນເພື່ອພິສູດໃນຮ່າງກາຍວ່າໂປຣຕີນ glycosylphosphatidylinositol ທີ່ສັງເຄາະໃໝ່ທີ່ມີສ່ວນປະກອບຂອງໄຂມັນ ceramide ຍາວຫຼາຍແມ່ນຖືກຈັດກຸ່ມ ແລະ ຈັດປະເພດເປັນ endoplasms ພິເສດ. ສະຖານທີ່ອອກສຸດທິ, ເຊິ່ງແຕກຕ່າງຈາກທີ່ໃຊ້ໂດຍໂປຣຕີນ transmembrane. ນອກຈາກນັ້ນ, ພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າຄວາມຍາວຂອງລະບົບຕ່ອງໂສ້ຂອງ ceramide ໃນເຍື່ອຫຸ້ມຈຸລັງ endoplasmic reticulum ແມ່ນມີຄວາມສຳຄັນຕໍ່ການເລືອກການຈັດຮຽງນີ້. ການສຶກສາຂອງພວກເຮົາໃຫ້ຫຼັກຖານໂດຍກົງໃນຮ່າງກາຍຄັ້ງທຳອິດເພື່ອຈັດປະເພດສິນຄ້າໂປຣຕີນໂດຍອີງໃສ່ຄວາມຍາວຂອງລະບົບຕ່ອງໂສ້ໄຂມັນເຂົ້າໄປໃນສະຖານທີ່ສົ່ງອອກທີ່ເລືອກໃນເສັ້ນທາງການຫຼั่ง.
ໃນຈຸລັງ eukaryotic, ໂປຣຕີນທີ່ສັງເຄາະຢູ່ໃນ endoplasmic reticulum (ER) ຈະຖືກຈັດຮຽງໃນລະຫວ່າງການຂົນສົ່ງຜ່ານເສັ້ນທາງການຫຼั่งເພື່ອສົ່ງໄປຍັງຈຸດໝາຍປາຍທາງຂອງຈຸລັງທີ່ເໝາະສົມ (1). ນອກເໜືອໄປຈາກການຈັດຮຽງໂດຍມີເປືອກຫຸ້ມ, ມັນໄດ້ຖືກຄາດເດົາມາດົນແລ້ວວ່າ lipids ບາງຊະນິດຍັງສາມາດເປັນຈຸດອອກທີ່ເລືອກໄດ້ໂດຍການຈັດກຸ່ມພວກມັນເຂົ້າໄປໃນໂດເມນເຍື່ອຫຸ້ມສະເພາະທີ່ໂປຣຕີນສະເພາະ (2-5). ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ຍັງຂາດຫຼັກຖານໂດຍກົງໃນຮ່າງກາຍເພື່ອພິສູດກົນໄກທີ່ອີງໃສ່ lipid ທີ່ເປັນໄປໄດ້ນີ້. ເພື່ອແກ້ໄຂບັນຫາພື້ນຖານນີ້, ພວກເຮົາໄດ້ສຶກສາໃນເຊື້ອລາວ່າ glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchored proteins (GPI-APs) ຖືກສົ່ງອອກຈາກ ER ແຕກຕ່າງກັນແນວໃດ. GPI-APs ແມ່ນໂປຣຕີນໜ້າຜິວຈຸລັງທີ່ເຊື່ອມຕໍ່ກັບ lipid ຫຼາກຫຼາຍຊະນິດ (6, 7). GPI-AP ແມ່ນໂປຣຕີນທີ່ຖືກຫຼั่งອອກມາທີ່ຕິດກັບໃບຍ່ອຍດ້ານນອກຂອງເຍື່ອຫຸ້ມ plasma ຜ່ານ glycolipid moiety (GPI anchor). ພວກມັນຍອມຮັບ GPI anchors ເປັນການດັດແປງຫຼັງການແປທີ່ອະນຸລັກໃນ ER lumen (8). ຫຼັງຈາກການຕິດຄັດ, GPI-AP ຈະຜ່ານອຸປະກອນ Golgi (5, 9) ຈາກ ER ໄປຫາເຍື່ອຫຸ້ມຈຸລັງ. ການມີຕົວຍຶດ GPI ເຮັດໃຫ້ GPI-AP ຖືກຂົນສົ່ງແຍກຕ່າງຫາກຈາກໂປຣຕີນທີ່ຖືກປ່ອຍອອກມາຈາກເຍື່ອຫຸ້ມຈຸລັງ (ລວມທັງໂປຣຕີນເຍື່ອຫຸ້ມຈຸລັງອື່ນໆ) ຕາມເສັ້ນທາງການຫຼั่ง (5, 9, 10). ໃນຈຸລັງເຊື້ອລາ, GPI-APs ຖືກແຍກອອກຈາກໂປຣຕີນທີ່ຖືກປ່ອຍອອກມາອື່ນໆໃນ reticulum endoplasmic, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນຖືກຫຸ້ມຫໍ່ເຂົ້າໄປໃນຖົງທີ່ເປັນເອກະລັກທີ່ຫໍ່ດ້ວຍສະລັບສັບຊ້ອນໂປຣຕີນເຄືອບ II (COPII) (6, 7). ຕົວກຳນົດຂອງຂະບວນການຈັດປະເພດນີ້ໃນຂະບວນການສົ່ງອອກ ER ຍັງບໍ່ຊັດເຈນ, ແຕ່ມີການຄາດເດົາວ່າກົນໄກນີ້ອາດຈະຕ້ອງການ lipids, ໂດຍສະເພາະການປັບປຸງໂຄງສ້າງຂອງສ່ວນ lipid ຂອງຕົວຍຶດ GPI (5, 8). ໃນເຊື້ອລາ, ການປັບປຸງ lipid GPI ເລີ່ມຕົ້ນທັນທີຫຼັງຈາກ GPI ຕິດຄັດ, ແລະໃນຫຼາຍໆກໍລະນີ, ມັນເຮັດໃຫ້ ceramide ຜູກມັດກັບກົດໄຂມັນອີ່ມຕົວ 26 ຄາບອນຍາວ (C26:0) (11, 12). C26 ceramide ເປັນ ceramide ຫຼັກທີ່ຜະລິດໂດຍຈຸລັງເຊື້ອລາມາຮອດປະຈຸບັນ. ມັນຖືກສັງເຄາະຢູ່ໃນ ER ແລະສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນສົ່ງອອກໄປຫາອຸປະກອນ Golgi ຜ່ານຖົງ COPII (13). ການສົ່ງອອກ ER ຂອງ GPI-AP ຮຽກຮ້ອງໃຫ້ມີການສັງເຄາະ ceramide ຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງ (14, 15), ແລະໃນທາງກັບກັນ, ການປ່ຽນ ceramide ເປັນ inositol phosphate ceramide (IPC) ໃນອຸປະກອນ Golgi ແມ່ນຂຶ້ນກັບການສັງເຄາະສະມໍ GPI (16). ການສຶກສາທາງຊີວະຟີຊິກສ໌ກັບເຍື່ອຫຸ້ມຈຸລັງທຽມໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ ceramides ລະບົບຕ່ອງໂສ້ acyl ທີ່ຍາວຫຼາຍສາມາດລວມຕົວກັນເພື່ອສ້າງໂດເມນທີ່ມີລະບຽບທີ່ມີຄຸນສົມບັດທາງກາຍະພາບທີ່ເປັນເອກະລັກ (17, 18). ຂໍ້ມູນເຫຼົ່ານີ້ນໍາໄປສູ່ສົມມຸດຕິຖານທີ່ວ່າ C26 ceramide ແລະ GPI-AP ທີ່ມີ C26 ceramide ໃຊ້ຄຸນສົມບັດທາງກາຍະພາບຂອງພວກມັນເພື່ອລວມຕົວກັນເປັນພາກພື້ນທີ່ມີລະບຽບຫຼືພາກພື້ນໃນສະພາບແວດລ້ອມ lipid ຂອງເຍື່ອຫຸ້ມຈຸລັງ ER ທີ່ຂ້ອນຂ້າງສັບສົນ. ມັນສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນປະກອບດ້ວຍ glycerolipids ສັ້ນແລະບໍ່ອີ່ມຕົວ (C16:1 ແລະ C18:1) (19, 20). ພາກພື້ນເຫຼົ່ານີ້ຈະຖືກສຸມໃສ່ຢ່າງເລືອກເຟັ້ນໃນສະຖານທີ່ອອກ ER ສະເພາະ (ERES), ບ່ອນທີ່ ceramide ແລະ GPI-AP ທີ່ອີງໃສ່ ceramide ສາມາດຂົນສົ່ງຮ່ວມກັນໄປຫາ Golgi ໃນຖົງ COPII ດຽວກັນ (5).
ໃນການສຶກສາຄັ້ງນີ້, ພວກເຮົາໄດ້ທົດສອບກົນໄກການອີງໃສ່ໄຂມັນນີ້ໂດຍກົງໂດຍການໃຊ້ກ້ອງຈຸລະທັດສະແກນພາບແບບເວລາຈິງທີ່ມີຄວາມລະອຽດສູງ (SCLIM), ເຊິ່ງເປັນເຕັກນິກກ້ອງຈຸລະທັດທີ່ທັນສະໄໝທີ່ສາມາດສັງເກດເຫັນໂປຣຕີນທີ່ມີປ້າຍ fluorescent ໄດ້ພ້ອມໆກັນ. ຮູບພາບສາມສີ ແລະ ສາມມິຕິ (3D) ມີຄວາມລະອຽດ ແລະ ຄວາມໄວສູງຫຼາຍໃນຈຸລັງທີ່ມີຊີວິດ (21, 22).
ພວກເຮົາໄດ້ນຳໃຊ້ເທັກໂນໂລຢີ SCLIM ທຳອິດເພື່ອກຳນົດວິທີການກວດສອບ GPI-AP ປົກກະຕິທີ່ມີກຸ່ມ ceramide C26 ຈາກໂປຣຕີນທີ່ປ່ອຍອອກມາຈາກເຍື່ອຫຸ້ມຈຸລັງຫຼັງຈາກອອກຈາກ ER ໃນ S. cerevisiae. ເພື່ອກວດສອບການຈັດປະເພດຂອງ ER, ພວກເຮົາໄດ້ໃຊ້ລະບົບພັນທຸກໍາທີ່ສາມາດເບິ່ງເຫັນສິນຄ້າທີ່ສັງເຄາະໃໝ່ທີ່ເຂົ້າສູ່ ERES ໃນຮ່າງກາຍໄດ້ໂດຍກົງ (7, 23). ໃນຖານະເປັນສິນຄ້າ, ພວກເຮົາໄດ້ເລືອກ C26 ceramide-based GPI-AP Gas1 ທີ່ຕິດສະຫຼາກດ້ວຍໂປຣຕີນ fluorescent ສີຂຽວ (GFP) ແລະໂປຣຕີນທີ່ປ່ອຍອອກມາຈາກເຍື່ອຫຸ້ມຈຸລັງ Mid2 ທີ່ຕິດສະຫຼາກດ້ວຍໂປຣຕີນ fluorescent ໃກ້ອິນຟາເຣດ (iRFP), ເຊິ່ງທັງສອງເປົ້າໝາຍແມ່ນເຍື່ອຫຸ້ມຈຸລັງ (24–26). ໃນ mutant ທີ່ມີຄວາມອ່ອນໄຫວຕໍ່ອຸນຫະພູມ sec31-1, ສິນຄ້າສອງຢ່າງນີ້ສະແດງອອກພາຍໃຕ້ promoter ທີ່ກະຕຸ້ນ galactose ແລະເຄື່ອງໝາຍ ERES ທີ່ເປັນສ່ວນປະກອບ. ໃນອຸນຫະພູມທີ່ຮຸນແຮງ (37°C), ເນື່ອງຈາກການກາຍພັນ sec31-1 ມີຜົນກະທົບຕໍ່ໜ້າທີ່ຂອງອົງປະກອບເຄືອບ COPII Sec31 ເພື່ອຍັບຍັ້ງການແຕກງອກຂອງ COPII ແລະ ການສົ່ງອອກ ER, ສິນຄ້າສັງເຄາະໃໝ່ຈະສະສົມຢູ່ທີ່ ER (23). ຫຼັງຈາກເຮັດໃຫ້ເຢັນລົງເຖິງອຸນຫະພູມຕ່ຳ (24°C), ຈຸລັງກາຍພັນ sec31-1 ທີ່ຟື້ນຕົວຈາກພື້ນທີ່ຫຼั่ง, ແລະ ສິນຄ້າສັງເຄາະໃໝ່ທີ່ສະສົມໄວ້ໄດ້ເລີ່ມສົ່ງອອກຈາກ ER. ການເບິ່ງເຫັນ CLIM ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ Gas1-GFP ແລະ Mid2-iRFP ທີ່ສັງເຄາະໃໝ່ສ່ວນໃຫຍ່ຍັງຄົງສະສົມຢູ່ໃນ ER ຂອງຈຸລັງກາຍພັນ sec31-1 ຫຼັງຈາກການຟັກຕົວທີ່ 37°C ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນປ່ອຍອອກມາທີ່ 24°C ເປັນເວລາ 5 ນາທີ (ຮູບທີ 1). ເນື່ອງຈາກ Mid2-iRFP ຖືກແຈກຢາຍຢູ່ໃນເຍື່ອຫຸ້ມ ER ທັງໝົດ, ແລະ Gas1-GFP ມີຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ ແລະ ລວບລວມຢູ່ໃນພື້ນທີ່ເຍື່ອຫຸ້ມ ER ທີ່ບໍ່ຕໍ່ເນື່ອງ, ການແຈກຢາຍຂອງພວກມັນຈຶ່ງແຕກຕ່າງກັນໝົດ (ຮູບທີ 1, A ຫາ C ແລະ Movie S1). ນອກຈາກນັ້ນ, ດັ່ງທີ່ສະແດງຢູ່ໃນຮູບທີ 1D, ກຸ່ມ Gas1-GFP ບໍ່ມີ Mid2-iRFP. ຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າ GPI-AP ແລະໂປຣຕີນ transmembrane ໄດ້ຖືກແຍກອອກເປັນພາກພື້ນເຍື່ອ ER ທີ່ແຕກຕ່າງກັນໃນຕອນຕົ້ນ. ກຸ່ມ Gas1-GFP ແມ່ນຢູ່ຕິດກັບ ERES ສະເພາະທີ່ມີໂປຣຕີນເຄືອບ COPII ຂອງ mCherry Sec13 (ຮູບທີ 1, E ແລະ F, ແລະຮູບເງົາ S1) (23).
ຈຸລັງ sec31-1 ສະແດງການຫຼั่งທີ່ເກີດຈາກ galactose, ລະບົບຕ່ອງໂສ້ acyl ຍາວ (C26) ceramide GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, ສີຂຽວ) ແລະໂປຣຕີນ transmembrane Mid2-iRFP (TMP, ສີຟ້າ) ແລະ Sec13-mCherry (ERES, magenta) ທີ່ຕິດສະຫຼາກ ERES ນີ້ໄດ້ຖືກບົ່ມຢູ່ທີ່ 37°C ເປັນເວລາ 30 ນາທີ, ຍ້າຍໄປທີ່ 24°C, ແລະຖ່າຍພາບໂດຍ SCLIM 5 ນາທີຕໍ່ມາ. (A ຫາ C) ສະແດງໃຫ້ເຫັນຮູບພາບ 2D ທີ່ລວມເຂົ້າກັນ ຫຼື ຮູບພາບດຽວຂອງລະນາບ (A), ຮູບພາບການສະແດງ 2D ຂອງ 10 ພາກສ່ວນ z (B) ຫຼື ຮູບພາບ hemisphere ຈຸລັງ 3D ຂອງສິນຄ້າ ແລະ ເຄື່ອງໝາຍ ERES (C). ແຖບຂະໜາດ 1μm (A ແລະ B). ຫົວໜ່ວຍຂະໜາດແມ່ນ 0.551μm (C). Gas1-GFP ໄດ້ຖືກກວດພົບໃນພາກພື້ນ ຫຼື ກຸ່ມ ER ແຍກຕ່າງຫາກ, ໃນຂະນະທີ່ Mid2-iRFP ໄດ້ຖືກກວດພົບ ແລະ ແຈກຢາຍທົ່ວເຍື່ອ ER (C). (D) ກຣາຟສະແດງໃຫ້ເຫັນຄວາມເຂັ້ມຂອງການເຍືອງແສງທຽບເທົ່າຂອງ Gas1-GFP ແລະ Mid2-iRFP ໃນກຸ່ມ Gas1-GFP ຕາມເສັ້ນລູກສອນສີຂາວ (ຊ້າຍ). AU, ຫົວໜ່ວຍທີ່ບໍ່ມີເງື່ອນໄຂ. (E ແລະ F) ສະແດງຮູບພາບ 3D ທີ່ລວມສິນຄ້າ ແລະ ເຄື່ອງໝາຍ ERES. ກຸ່ມ Gas1-GFP ໄດ້ຖືກກວດພົບຢູ່ໃກ້ກັບ ERES ສະເພາະ. ຫົວໜ່ວຍຂະໜາດແມ່ນ 0.551μm. (F) ລູກສອນສີຂາວເຂັ້ມໝາຍກຸ່ມ Gas1-GFP ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ ERES. ແຜງກາງ ແລະ ຂວາສະແດງຮູບພາບ 3D ທີ່ຂະຫຍາຍໃຫຍ່ຂຶ້ນ ແລະ ມຸມມອງທີ່ໝຸນຂອງກຸ່ມ Gas1-GFP ທີ່ເລືອກ.
ຄວາມສຳພັນທາງພື້ນທີ່ທີ່ໃກ້ຊິດລະຫວ່າງກຸ່ມ Gas1-GFP ແລະ ERES ສະເພາະຊີ້ບອກວ່າ Gas1-GFP ສາມາດເຂົ້າໄປໃນ ERES ທີ່ເລືອກເຟັ້ນໄດ້, ເຊິ່ງແຕກຕ່າງຈາກການເລືອກເຟັ້ນທີ່ໃຊ້ໂດຍ Mid2-iRFP ເພື່ອອອກຈາກ ER. ເພື່ອແກ້ໄຂຄວາມເປັນໄປໄດ້ນີ້, ພວກເຮົາໄດ້ຄິດໄລ່ອັດຕາສ່ວນ ERES ສຳລັບສິນຄ້າພຽງໜຶ່ງຫຼືສອງຢ່າງ (ຮູບທີ 2, A ຫາ C). ພວກເຮົາພົບວ່າ ERES ສ່ວນໃຫຍ່ (70%) ມີພຽງແຕ່ປະເພດສິນຄ້າດຽວເທົ່ານັ້ນ. ຮູບພາບລຸ່ມສຸດຂອງຮູບທີ 2C ສະແດງໃຫ້ເຫັນສອງຕົວຢ່າງທົ່ວໄປຂອງ ERES ທີ່ມີພຽງແຕ່ Gas1-GFP (ຮູບທີ 1) ຫຼືພຽງແຕ່ Mid2-iRFP (ຮູບທີ 2). ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, ປະມານ 20% ຂອງ ERES ປະກອບດ້ວຍສິນຄ້າສອງຢ່າງທີ່ຊ້ອນກັນໃນພື້ນທີ່ດຽວກັນ. ພົບວ່າ ERES ບາງອັນ (10%) ປະກອບດ້ວຍສິນຄ້າສອງປະເພດ, ແຕ່ພວກມັນຖືກແຍກອອກໃນພື້ນທີ່ທີ່ແຕກຕ່າງກັນຢ່າງຈະແຈ້ງ. ດັ່ງນັ້ນ, ການວິເຄາະທາງສະຖິຕິນີ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າຫຼັງຈາກ ER ຖືກສົ່ງອອກ, GPI-AP Gas1-GFP ແລະສິນຄ້າຜ່ານເຍື່ອ Mid2-iRFP ແບ່ງອອກເປັນ ERES ທີ່ແຕກຕ່າງກັນ (ຮູບທີ 2D). ປະສິດທິພາບການຈັດຮຽງນີ້ແມ່ນສອດຄ່ອງກັບການວິເຄາະທາງຊີວະເຄມີກ່ອນໜ້ານີ້ (6) ແລະ ການກຳນົດຮູບຮ່າງທາງສະລີລະວິທະຍາ (7). ພວກເຮົາຍັງສາມາດສັງເກດພຶດຕິກຳຂອງສິນຄ້າທີ່ຖືກກັກກັນທີ່ເຂົ້າໄປໃນ ERES (ຮູບທີ 2E ແລະ ຮູບເງົາ S2). ຮູບທີ 2E ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າມີພຽງສ່ວນນ້ອຍໆຂອງ Gas1-GFP (ແຜງ 3) ຫຼື Mid2-iRFP (ແຜງ 4) ເຂົ້າໄປໃນ ERES ຈາກດ້ານໜຶ່ງ ແລະ ຖືກຈຳກັດຢູ່ໃນພື້ນທີ່ແຍກຕ່າງຫາກ. ແຜງທີ 5 ຂອງຮູບທີ 2E ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ Gas1-GFP ແລະ Mid2-iRFP ບາງຄັ້ງພົບໃນ ERES ດຽວກັນ, ແຕ່ພວກມັນເຂົ້າຈາກດ້ານທີ່ແຕກຕ່າງກັນ ແລະ ມີຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຢູ່ໃນພາກພື້ນແຍກຕ່າງຫາກທີ່ອາດຈະເປັນຕົວແທນຂອງຖົງ COPII ທີ່ແຕກຕ່າງກັນ. ພວກເຮົາຍັງໄດ້ຢືນຢັນວ່າການແຍກ ແລະ ການຈັດປະເພດຂອງ C26 ceramide-based GPI-AP Gas1 ເປັນ ERES ທີ່ເລືອກເຟັ້ນແມ່ນສະເພາະເພາະວ່າສິນຄ້າການຫຼั่งຜ່ານເຍື່ອຫຸ້ມເຊລອີກອັນໜຶ່ງ, ໂປຣຕີນເຍື່ອຫຸ້ມເຊລ Axl2 (27) ທີ່ຕິດປ້າຍ GFP, ສະແດງໃຫ້ເຫັນພຶດຕິກຳທີ່ຄ້າຍຄືກັນກັບ Mid2-iRFP. (ຮູບທີ S1 ແລະ ຮູບເງົາ S3). Axl2-GFP ທີ່ສັງເຄາະໃໝ່ແມ່ນແຈກຢາຍຜ່ານເຍື່ອ ER ເຊັ່ນ Mid2-iRFP (ຮູບ S1, A ແລະ B), ແລະຖືກລວມເຂົ້າກັບ Mid2-iRFP ໃນ ERES ສ່ວນໃຫຍ່ (ຮູບ S1, B ຫາ D). ແຜງ 1 ແລະ 2 ຂອງຮູບທີ 1. S1C ສະແດງໃຫ້ເຫັນສອງຕົວຢ່າງທົ່ວໄປຂອງ ERES ບ່ອນທີ່ສິນຄ້າຜ່ານເຍື່ອສອງອັນຊ້ອນກັນ. ໃນກໍລະນີເຫຼົ່ານີ້, ສິນຄ້າທັງສອງເຂົ້າສູ່ ERES ຮ່ວມກັນ (ຮູບ S1E, ແຜງ 3 ແລະ Movie S3).
ຈຸລັງ sec31-1 ທີ່ສະແດງອອກເຖິງການຫຼั่งທີ່ສາມາດກະຕຸ້ນ galactose ໄດ້, Gas1-GFP (GPI-AP, ສີຂຽວ) ແລະ Mid2-iRFP (TMP, ສີຟ້າ) ແລະ ການຕິດສະຫຼາກ ERES ທີ່ເປັນສ່ວນປະກອບ Sec13-mCherry (ERES, ສີມ່ວງອ່ອນ) ໄດ້ຖືກວາງໄວ້ທີ່ 37 ຫຼັງຈາກຟັກເປັນເວລາ 30 ນາທີທີ່ °C, ໃຫ້ຍ້າຍໄປທີ່ 24 °C ເພື່ອປ່ອຍບລັອກການຫຼั่ง, ແລະຖ່າຍພາບດ້ວຍ SCLIM ຫຼັງຈາກ 20 ນາທີ. (A ຫາ C) ຮູບພາບການສະແດງ 2D ທີ່ເປັນຕົວແທນ (A; ແຖບຂະໜາດ, 1μm) ຫຼື ຮູບພາບຊີກໂລກຈຸລັງ 3D (B ແລະ C; ຫົວໜ່ວຍຂະໜາດ, 0.456μm) ຂອງສິນຄ້າ ແລະ 10 ສ່ວນ z ທີ່ໝາຍໂດຍ ERES. ແຜງດ້ານລຸ່ມໃນ (B) ແລະ ແຜງໃນ (C) ສະແດງຮູບພາບທີ່ປະມວນຜົນແລ້ວເພື່ອສະແດງພຽງແຕ່ສິນຄ້າທີ່ມີຢູ່ໃນ ERES (ສີມ່ວງອ່ອນ) [Gas1-GFP (ສີເທົາ) ແລະ Mid2-iRFP (ສີຟ້າອ່ອນ)]. (C) ລູກສອນເປີດ: ERES ບັນຈຸສິນຄ້າພຽງຊິ້ນດຽວ (1 ຫາ 4). ລູກສອນສີເທົາ: ERES ປະກອບດ້ວຍສິນຄ້າແຍກຕ່າງຫາກ (5). ລູກສອນສີຂາວເຂັ້ມ: ERES ປະກອບດ້ວຍສິນຄ້າທີ່ຢູ່ຮ່ວມກັນ. ຂ້າງລຸ່ມນີ້: ERES ດ່ຽວທີ່ເລືອກມີພຽງແຕ່ Gas1-GFP (1) ຫຼື Mid2-iRFP (2). ແຖບຂະໜາດ, 100 nm. (D) ການວັດແທກປະລິມານຂອງຮູບຖ່າຍຈຸລະທັດທີ່ອະທິບາຍໄວ້ໃນ (C). ເປີເຊັນສະເລ່ຍຂອງ ERES ທີ່ປະກອບດ້ວຍສິນຄ້າພຽງອັນດຽວ (Gas1-GFP ຫຼື Mid2-iRFP), ສິນຄ້າແຍກຕ່າງຫາກ ແລະ ສິນຄ້າທີ່ຊ້ອນກັນ. ໃນການທົດລອງສາມຄັ້ງທີ່ເປັນອິດສະຫຼະ, n=432 ໃນ 54 ເຊວ. ແຖບຄວາມຜິດພາດ = SD. ການທົດສອບ t ສອງຫາງທີ່ບໍ່ມີຄູ່. *** P = 0.0002. (E) ຮູບພາບ 3 ມິຕິຂອງ ERES ທີ່ເລືອກຂອງສິນຄ້າທີ່ຖືກກັກກັນທີ່ໝາຍດ້ວຍ (C). Gas1-GFP (ສີຂຽວ) (3) ຫຼື Mid2-iRFP (ສີຟ້າ) (4) ເຂົ້າສູ່ ERES (ສີມ່ວງອ່ອນ) ຈາກດ້ານໜຶ່ງ ແລະ ຖືກຈຳກັດຢູ່ໃນພື້ນທີ່ນ້ອຍໆພາຍໃນ ERES. ບາງຄັ້ງ, ສິນຄ້າທັງສອງປະເພດເຂົ້າສູ່ ERES (5) ດຽວກັນຈາກດ້ານດຽວກັນ ແລະ ຖືກຈຳກັດຢູ່ໃນພື້ນທີ່ໂດດດ່ຽວພາຍໃນ ERES. ຂະໜາດແຖບ, 100 nm.
ຕໍ່ໄປ, ພວກເຮົາໄດ້ທົດສອບສົມມຸດຕິຖານທີ່ວ່າ ceramide ລະບົບຕ່ອງໂສ້ acyl ຍາວ (C26) ທີ່ມີຢູ່ໃນເຍື່ອ ER ຂັບເຄື່ອນການຈັດກຸ່ມສະເພາະ ແລະ ການຈັດຮຽງ Gas1 ເຂົ້າໄປໃນ ERES ທີ່ເລືອກເຟັ້ນ. ເພື່ອຈຸດປະສົງນີ້, ພວກເຮົາໄດ້ໃຊ້ເຊື້ອລາທີ່ຖືກດັດແປງ GhLag1, ເຊິ່ງສອງ ceramide synthases ພາຍໃນຄື Lag1 ແລະ Lac1 ໄດ້ຖືກທົດແທນດ້ວຍ GhLag1 ( homolog Lag1 ຂອງຝ້າຍ), ເຊິ່ງສົ່ງຜົນໃຫ້ເຊື້ອລາທີ່ມີເຊື້ອລາ Ceramide ໃນເຍື່ອຫຸ້ມເຊລສັ້ນກວ່າຊະນິດທຳມະຊາດ (ຮູບທີ 3A) (28). ການວິເຄາະ mass spectrometry (MS) ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າໃນເຊື້ອລາທຳມະຊາດ, 95% ຂອງ ceramide ທັງໝົດແມ່ນ ceramide ລະບົບຕ່ອງໂສ້ຍາວຫຼາຍ (C26), ໃນຂະນະທີ່ໃນ GhLag1, 85% ຂອງ ceramide ຍາວຫຼາຍ (C18 ແລະ C16). ), ມີພຽງແຕ່ 2% ຂອງ ceramide ເທົ່ານັ້ນທີ່ເປັນ ceramide ລະບົບຕ່ອງໂສ້ຍາວຫຼາຍ (C26). ເຖິງແມ່ນວ່າ C18 ແລະ C16 ceramides ເປັນ ceramides ຫຼັກທີ່ກວດພົບໃນເຍື່ອ GhLag1 ມາຮອດປະຈຸບັນ, ການວິເຄາະ MS ຍັງຢືນຢັນວ່າຈຸດຍຶດ GPI ຂອງ Gas1-GFP ທີ່ສະແດງອອກໃນເຊື້ອ GhLag1 ປະກອບດ້ວຍ C26 ceramide, ເຊິ່ງສາມາດປຽບທຽບກັບ lipids ປະເພດທຳມະຊາດ. ຄຸນນະພາບແມ່ນຄືກັນ (ຮູບທີ 3A) (26). ດັ່ງນັ້ນ, ນີ້ໝາຍຄວາມວ່າ enzyme remodeling ceramide Cwh43 ແມ່ນເລືອກສູງສຳລັບ C26 ceramide, ດັ່ງທີ່ສະແດງຢູ່ໃນຮູບທີ 26, ມັນລວມເອົາຈຸດຍຶດ GPI ຈາກປະລິມານໜ້ອຍຂອງ C26 ceramide ໃນເຊື້ອ GhLag1. S2 (29). ເຖິງຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ເຍື່ອຫຸ້ມເຊລຂອງ GhLag1 ໂດຍພື້ນຖານແລ້ວມີພຽງແຕ່ C18-C16 ceramide, ໃນຂະນະທີ່ Gas1-GFP ຍັງມີ C26 ceramide. ຄວາມຈິງນີ້ເຮັດໃຫ້ເຊື້ອນີ້ເປັນເຄື່ອງມືທີ່ເໝາະສົມເພື່ອແກ້ໄຂບັນຫາຄວາມຍາວຂອງຕ່ອງໂສ້ acyl ຂອງເຍື່ອ ceramide ໃນ ER ໂດຍສະເພາະ. ບົດບາດສົມມຸດຕິຖານຂອງການຈັດປະເພດ ແລະ ການຈັດຮຽງ. ຈາກນັ້ນ, ພວກເຮົາໄດ້ສຶກສາຄວາມສາມາດຂອງ C26 Gas1-GFP ໃນການສະສົມເປັນກຸ່ມໃນ GhLag1 ດ້ວຍ allele ກາຍພັນທີ່ມີຄວາມອ່ອນໄຫວຕໍ່ອຸນຫະພູມຂອງ sec31-1 ຜ່ານກ້ອງຈຸລະທັດ fluorescence ແບບທຳມະດາ, ບ່ອນທີ່ມີພຽງແຕ່ລະບົບຕ່ອງໂສ້ຍາວ (C18-C16) ເທົ່ານັ້ນທີ່ມີຢູ່ໃນເຍື່ອ ER Ceramide (ຮູບທີ 3). ພວກເຮົາສັງເກດເຫັນວ່າໃນ sec31-1, Gas1-GFP ສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນເຂັ້ມຂຸ້ນຢູ່ໃນກຸ່ມ, ໃນຂະນະທີ່ Gas1-GFP ໃນ sec31-1 GhLag1 ທີ່ມີເຍື່ອ ER ceramide ຍາວ (C18-C16) ສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນບໍ່ໄດ້ລວມກຸ່ມ ແລະ ແຈກຢາຍຢູ່ໃນເຍື່ອ ER ທັງໝົດ. ເພື່ອໃຫ້ຊັດເຈນ, ເນື່ອງຈາກການຈັດກຸ່ມທີ່ອີງໃສ່ ceramide C26 ແມ່ນກ່ຽວຂ້ອງຢ່າງໃກ້ຊິດກັບ ERES ສະເພາະ (ຮູບທີ 1), ຕໍ່ມາພວກເຮົາໄດ້ສືບສວນວ່າຂະບວນການນີ້ອາດຈະກ່ຽວຂ້ອງກັບໜ້າທີ່ຂອງກົນໄກໂປຣຕີນສົ່ງອອກ ER ຫຼືບໍ່. GPI-AP ໃຊ້ລະບົບ COPII ພິເສດສຳລັບການສົ່ງອອກ ER, ເຊິ່ງຖືກຄວບຄຸມຢ່າງຫ້າວຫັນໂດຍການປັບປຸງໂຄງສ້າງຂອງ Ted1 ຂອງສ່ວນ glycan ຂອງສະມໍ GPI (30, 31). ຫຼັງຈາກນັ້ນ, recombinant GPI-glycan ຈະຖືກຮັບຮູ້ໂດຍສະລັບສັບຊ້ອນ p24 ຂອງຕົວຮັບສິນຄ້າຜ່ານເຍື່ອ, ເຊິ່ງໃນທາງກັບກັນຈະຮັບເອົາ Lst1 ຢ່າງເລືອກເຟັ້ນ, ເຊິ່ງເປັນ isoform ສະເພາະຂອງໜ່ວຍຍ່ອຍຜູກມັດສິນຄ້າ COPII ຫຼັກ Sec24, ປະກອບເປັນຖົງ COPII ທີ່ອຸດົມສົມບູນ GPI-AP (31-33). ດັ່ງນັ້ນ, ພວກເຮົາໄດ້ສ້າງ mutant ຄູ່ທີ່ລວມເອົາການລຶບໂປຣຕີນດ່ຽວເຫຼົ່ານີ້ (ອົງປະກອບສະລັບສັບຊ້ອນ p24 Emp24, ເອນໄຊປັບປຸງ GPI-glycan Ted1 ແລະໜ່ວຍຍ່ອຍ COPII ສະເພາະ Lst1) ກັບເຊື້ອ mutant sec31-1, ແລະສຶກສາພວກມັນ ມັນເປັນໄປໄດ້ບໍທີ່ຈະສ້າງ GFP ກຸ່ມ Gas1 (ຮູບທີ 3). ພວກເຮົາສັງເກດເຫັນວ່າໃນ sec31-1emp24Δ ແລະ sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP ສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນ ungrouped ແລະແຈກຢາຍທົ່ວເຍື່ອ ER, ດັ່ງທີ່ເຄີຍເຫັນໃນ sec31-1 GhLag1, ໃນຂະນະທີ່ໃນ sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP ຄືກັນກັບ sec31-1. ຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່ານອກເໜືອໄປຈາກການມີ C26 ceramide ໃນເຍື່ອ ER, ການຈັດກຸ່ມຂອງ Gas1-GFP ຍັງຈຳເປັນຕ້ອງຜູກມັດກັບສະລັບສັບຊ້ອນ p24, ແລະບໍ່ຕ້ອງການການຮັບສະໝັກ Lst1 ສະເພາະ. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ພວກເຮົາໄດ້ຄົ້ນຫາຄວາມເປັນໄປໄດ້ວ່າຄວາມຍາວຂອງລະບົບຕ່ອງໂສ້ຂອງ ceramide ໃນເຍື່ອ ER ສາມາດຄວບຄຸມການຜູກມັດຂອງ Gas1-GFP ກັບ p24. ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ພວກເຮົາພົບວ່າການມີ C18-C16 ceramide ໃນເຍື່ອບໍ່ມີຜົນກະທົບຕໍ່ GPI-glycans ທີ່ສ້າງຂຶ້ນໃໝ່ໂດຍສະລັບສັບຊ້ອນ p24 (ຮູບ S3 ແລະ S4, A ແລະ B) ຫຼືການຜູກມັດກັບ GPI-AP ແລະຄວາມສາມາດໃນການສົ່ງອອກ GPI-AP. ຮັບສະໝັກ COPII subtype Lst1 (ຮູບ S4C). ດັ່ງນັ້ນ, ການຈັດກຸ່ມທີ່ຂຶ້ນກັບ ceramide C26 ບໍ່ຕ້ອງການການພົວພັນກັບໂປຣຕີນກັບກົນໄກການສົ່ງອອກໂປຣຕີນ ER ທີ່ແຕກຕ່າງກັນ, ແຕ່ສະໜັບສະໜູນກົນໄກການຈັດຮຽງທາງເລືອກທີ່ຂັບເຄື່ອນໂດຍຄວາມຍາວຂອງ lipid. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ພວກເຮົາໄດ້ວິເຄາະວ່າຄວາມຍາວຂອງລະບົບຕ່ອງໂສ້ ceramide acyl ໃນເຍື່ອ ER ມີຄວາມສຳຄັນຕໍ່ການຈັດປະເພດທີ່ມີປະສິດທິພາບຂອງ Gas1-GFP ເປັນ ERES ທີ່ເລືອກເຟັ້ນຫຼືບໍ່. ເນື່ອງຈາກ Gas1 ໃນເຊື້ອ GhLag1 ທີ່ມີ ceramide ລະບົບຕ່ອງໂສ້ສັ້ນອອກຈາກ ER ແລະ ເຂົ້າໄປໃນເຍື່ອຫຸ້ມ plasma (ຮູບ S5), ພວກເຮົາເຊື່ອວ່າຖ້າການຈັດຮຽງຖືກຂັບເຄື່ອນໂດຍຄວາມຍາວຂອງລະບົບຕ່ອງໂສ້ ceramide acyl, Gas1 ໃນເຊື້ອ GhLag1 ສາມາດຖືກປ່ຽນເສັ້ນທາງ ແລະ ຂ້າມຜ່ານສິນຄ້າ ERES ທີ່ມີເຍື່ອຫຸ້ມດຽວກັນ.
(ກ) ເຍື່ອຫຸ້ມເຊວຂອງ GhLag1 ສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນປະກອບດ້ວຍເຊຣາໄມ C18-C16 ທີ່ສັ້ນກວ່າ, ໃນຂະນະທີ່ຈຸດຍຶດ GPI ຂອງ Gas1-GFP ຍັງມີ C26 IPC ຄືກັນກັບເຊວປະເພດທຳມະຊາດ. ຂ້າງເທິງ: ການວິເຄາະຄວາມຍາວຂອງຕ່ອງໂສ້ acyl ຂອງເຊຣາໄມໃນເຍື່ອຫຸ້ມເຊວຂອງເຊື້ອພັນປະເພດທຳມະຊາດ (Wt) ແລະ GhLag1p ໂດຍການວິເຄາະມວນສານ (MS). ຂໍ້ມູນສະແດງເຖິງອັດຕາສ່ວນຂອງເຊຣາໄມທັງໝົດ. ຄ່າສະເລ່ຍຂອງການທົດລອງເອກະລາດສາມຄັ້ງ. ແຖບຄວາມຜິດພາດ = SD. ການທົດສອບ t ສອງຫາງທີ່ບໍ່ມີຄູ່. **** P <0.0001. ແຜງດ້ານລຸ່ມ: ການວິເຄາະ MS ຂອງຄວາມຍາວຂອງຕ່ອງໂສ້ acyl ຂອງ IPC ທີ່ມີຢູ່ໃນຈຸດຍຶດ GPI ຂອງ Gas1-GFP (GPI-IPC) ທີ່ສະແດງອອກໃນເຊື້ອພັນປະເພດທຳມະຊາດ ແລະ GhLag1p. ຂໍ້ມູນສະແດງເຖິງອັດຕາສ່ວນຂອງສັນຍານ IPC ທັງໝົດ. ຄ່າສະເລ່ຍຂອງການທົດລອງເອກະລາດຫ້າຄັ້ງ. ແຖບຄວາມຜິດພາດ = SD. ການທົດສອບ t ສອງຫາງທີ່ບໍ່ມີຄູ່. ns, ບໍ່ສຳຄັນ. P = 0.9134. (B) ຮູບຖ່າຍຈຸລະທັດການເຍືອງແສງຂອງຈຸລັງ sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ ແລະ sec31-1lst1Δ ທີ່ສະແດງອອກເຖິງ Gas1-GFP ທີ່ເກີດຈາກ galactose ໄດ້ຖືກບົ່ມໄວ້ທີ່ອຸນຫະພູມ 37°C ເປັນເວລາ 30 ນາທີ ແລະ ສົ່ງຕໍ່ໄປເພື່ອປະຕິບັດກ້ອງຈຸລະທັດການເຍືອງແສງປົກກະຕິຫຼັງຈາກ 24°C. ລູກສອນສີຂາວ: ກຸ່ມ Gas1-GFP ER. ລູກສອນເປີດ: Gas1-GFP ທີ່ບໍ່ໄດ້ຈັດກຸ່ມແມ່ນແຈກຢາຍຢູ່ໃນເຍື່ອຫຸ້ມ ER ທັງໝົດ, ສະແດງໃຫ້ເຫັນການຍ້ອມສີວົງແຫວນນິວເຄຼຍທີ່ມີລັກສະນະ ER. ແຖບຂະໜາດ, 5μm. (C) ປະລິມານຂອງຮູບຖ່າຍຈຸລະທັດທີ່ອະທິບາຍໄວ້ໃນ (B). ເປີເຊັນສະເລ່ຍຂອງຈຸລັງທີ່ມີໂຄງສ້າງ Gas1-GFP ແບບຈຸດ. ໃນການທົດລອງເອກະລາດສາມຄັ້ງ, n≥300 ຈຸລັງ. ແຖບຄວາມຜິດພາດ = SD. ການທົດສອບ t ສອງຫາງທີ່ບໍ່ມີຄູ່. **** P <0.0001.
ເພື່ອແກ້ໄຂບັນຫານີ້ໂດຍກົງ, ພວກເຮົາໄດ້ປະຕິບັດການເບິ່ງເຫັນ SCLIM ຂອງ Gas1-GFP ແລະ Mid2-iRFP ໃນ GhLag1 ດ້ວຍ allele ກາຍພັນທີ່ມີຄວາມອ່ອນໄຫວຕໍ່ອຸນຫະພູມ sec31-1 (ຮູບທີ 4 ແລະ Movie S4). ຫຼັງຈາກ ER ຖືກຮັກສາໄວ້ທີ່ 37°C ແລະຕໍ່ມາຖືກປ່ອຍອອກມາທີ່ 24°C, Gas1-GFP ທີ່ສັງເຄາະໃໝ່ສ່ວນໃຫຍ່ບໍ່ໄດ້ຖືກຈັດກຸ່ມ ແລະ ແຈກຢາຍໄປທົ່ວເຍື່ອ ER, ດັ່ງທີ່ສັງເກດເຫັນໂດຍກ້ອງຈຸລະທັດທຳມະດາ (ຮູບທີ 4, A ແລະ B). ນອກຈາກນັ້ນ, ເປີເຊັນໃຫຍ່ຂອງ ERES (67%) ປະກອບມີສອງປະເພດຂອງສິນຄ້າທີ່ຕັ້ງຢູ່ຮ່ວມກັນໃນນັ້ນ (ຮູບທີ 4D). ແຜງທີ 1 ແລະ 2 ຂອງຮູບທີ 4C ສະແດງໃຫ້ເຫັນສອງຕົວຢ່າງທົ່ວໄປຂອງ ERES ທີ່ມີ Gas1-GFP ແລະ Mid2-GFP ທີ່ຊ້ອນກັນ. ນອກຈາກນັ້ນ, ສິນຄ້າທັງສອງໄດ້ຖືກຄັດເລືອກເຂົ້າໄປໃນ ERES ດຽວກັນ (ຮູບທີ 4E, ແຜງທີ 3 ແລະ movie S4). ດັ່ງນັ້ນ, ຜົນໄດ້ຮັບຂອງພວກເຮົາຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າຄວາມຍາວຂອງລະບົບຕ່ອງໂສ້ ceramide acyl ໃນເຍື່ອ ER ເປັນຕົວກຳນົດທີ່ສຳຄັນຂອງການລວມຕົວ ແລະ ການຈັດປະເພດໂປຣຕີນ ER.
ຈຸລັງ Sec31-1 GhLag1 ທີ່ສະແດງອອກເຖິງສານຄັດຫຼັ່ງທີ່ເກີດຈາກ galactose, Gas1-GFP (GPI-AP, ສີຂຽວ) ແລະ Mid2-iRFP (TMP, ສີຟ້າ) ແລະ Sec13-mCherry (ERES, ສີມ່ວງແດງ) ທີ່ຕິດປ້າຍ ERES ຟັກຢູ່ທີ່ 37°C. ສືບຕໍ່ເປັນເວລາ 30 ນາທີ, ຫຼຸດລົງເຖິງ 24°C ເພື່ອປ່ອຍສານຄັດຫຼັ່ງ, ແລະຖ່າຍພາບດ້ວຍ SCLIM ຫຼັງຈາກ 20 ນາທີ. (A ຫາ C) ຮູບພາບການສະແດງ 2D ທີ່ເປັນຕົວແທນ (A; ແຖບຂະໜາດ, 1μm) ຫຼື ຮູບພາບຊີກໂລກຈຸລັງ 3D (B ແລະ C; ຫົວໜ່ວຍຂະໜາດ, 0.45μm) ຂອງ 10 ສ່ວນ z ທີ່ໝາຍໂດຍສິນຄ້າ ແລະ ERES. ແຜງດ້ານລຸ່ມໃນ (B) ແລະ ແຜງໃນ (C) ສະແດງຮູບພາບທີ່ປະມວນຜົນແລ້ວເພື່ອສະແດງພຽງແຕ່ສິນຄ້າທີ່ມີຢູ່ໃນ ERES (ສີມ່ວງແດງ) [Gas1-GFP (ສີເທົາ) ແລະ Mid2-iRFP (ສີຟ້າອ່ອນ)]. (C) ລູກສອນສີຂາວ: ERES, ສິນຄ້າຊ້ອນກັນ. ລູກສອນເປີດ: ERES ມີພຽງແຕ່ລາຍການດຽວເທົ່ານັ້ນ. ແຜງດ້ານລຸ່ມ: ERES ທີ່ເລືອກມີສິນຄ້າທີ່ຊ້ອນກັນ (1 ແລະ 2) ທີ່ໝາຍໄວ້ໃນ (C). ແຖບຂະໜາດ, 100 nm. (D) ການວັດແທກປະລິມານຂອງໂຟໂຕໄມໂຄຣກຣາຟທີ່ອະທິບາຍໄວ້ໃນ (C). ໃນຫົວໜ່ວຍ sec31-1 ແລະ sec31-1 GhLag1, ມີພຽງແຕ່ສິນຄ້າດຽວ (Gas1-GFP ຫຼື Mid2-iRFP) ເທົ່ານັ້ນທີ່ລວມຢູ່, ແລະອັດຕາສ່ວນສະເລ່ຍຂອງ ERES ສຳລັບສິນຄ້າທີ່ໂດດດ່ຽວ ແລະ ສິນຄ້າທີ່ຊ້ອນກັນ. ໃນການທົດລອງເອກະລາດສາມຄັ້ງ, n = 432 ໃນ 54 ເຊວ (sec31-1) ແລະ n = 430 ໃນ 47 ເຊວ (sec31-1 GhLag1). ແຖບຄວາມຜິດພາດ = SD. ການທົດສອບ t ສອງຫາງທີ່ບໍ່ມີຄູ່. *** P = 0.0002 (sec31-1) ແລະ ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) ຮູບພາບ 3D ຂອງ ERES ທີ່ເລືອກທີ່ມີສິນຄ້າທີ່ຊ້ອນກັນ (3) ທີ່ໝາຍໄວ້ໃນ (C). Gas1-GFP (ສີຂຽວ) ແລະ Mid2-iRFP (ສີຟ້າ) ເຂົ້າໃກ້ ERES (ສີມ່ວງແດງ) ຈາກດ້ານດຽວກັນ ແລະ ຢູ່ໃນພື້ນທີ່ຈຳກັດ ERES ດຽວກັນ. ແຖບຂະໜາດ, 100 nm.
ການສຶກສານີ້ໃຫ້ຫຼັກຖານໂດຍກົງໃນຮ່າງກາຍວ່າສິນຄ້າໂປຣຕີນທີ່ອີງໃສ່ໄຂມັນຖືກຈັດປະເພດເປັນສະຖານທີ່ສົ່ງອອກທີ່ເລືອກໃນເສັ້ນທາງການຫຼั่ง, ແລະເປີດເຜີຍຄວາມສຳຄັນຂອງຄວາມຍາວຂອງລະບົບຕ່ອງໂສ້ acyl ສຳລັບການເລືອກການຈັດປະເພດ. ໂດຍການໃຊ້ເຕັກນິກກ້ອງຈຸລະທັດທີ່ມີປະສິດທິພາບ ແລະ ທັນສະໄໝທີ່ເອີ້ນວ່າ SCLIM, ພວກເຮົາໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນ Gas1-GFP ທີ່ສັງເຄາະໃໝ່ (ເຍື່ອຫຸ້ມຈຸລັງຫຼັກ GPI-AP ທີ່ມີສ່ວນ lipid ຂອງລະບົບຕ່ອງໂສ້ acyl ທີ່ຍາວຫຼາຍ (C26) ceramide ໃນເຊື້ອລາ) ພາກພື້ນທີ່ຈັດກຸ່ມຢູ່ໃນ ERs ແຍກຕ່າງຫາກແມ່ນກ່ຽວຂ້ອງກັບ ERES ສະເພາະ, ໃນຂະນະທີ່ໂປຣຕີນທີ່ຫຼั่งອອກມາຈາກເຍື່ອຫຸ້ມຈຸລັງແມ່ນແຈກຢາຍໄປທົ່ວເຍື່ອຫຸ້ມຈຸລັງ ER (ຮູບທີ 1). ນອກຈາກນັ້ນ, ສິນຄ້າສອງປະເພດນີ້ເຂົ້າສູ່ ERES ທີ່ແຕກຕ່າງກັນຢ່າງເລືອກເຟັ້ນ (ຮູບທີ 2). ຄວາມຍາວຂອງລະບົບຕ່ອງໂສ້ acyl ຂອງ ceramide ຂອງເຊລໃນເຍື່ອຫຸ້ມຈຸລັງຫຼຸດລົງຈາກ C26 ເປັນ C18-C16, ກຸ່ມ Gas1-GFP ຖືກກະຈາຍເຂົ້າໄປໃນພາກພື້ນ ER ແຍກຕ່າງຫາກ, ແລະ Gas1-GFP ຖືກປ່ຽນເສັ້ນທາງເພື່ອອອກຈາກ ER ດ້ວຍໂປຣຕີນ transmembrane ຜ່ານ ERES ດຽວກັນ (ຮູບທີ 3 ແລະຮູບທີ 3). 4).
ເຖິງແມ່ນວ່າ GPI-AP ໃຊ້ກົນໄກໂປຣຕີນພິເສດເພື່ອອອກຈາກ ER, ພວກເຮົາພົບວ່າການແຍກຕົວທີ່ຂຶ້ນກັບ ceramide ຂອງ C26 ບໍ່ໄດ້ອີງໃສ່ປະຕິກິລິຍາໂປຣຕີນທີ່ແຕກຕ່າງກັນທີ່ອາດຈະນໍາໄປສູ່ການພິເສດຂອງ ERES (ຮູບ S4 ແລະ S5). ແທນທີ່ຈະ, ການຄົ້ນພົບຂອງພວກເຮົາສະໜັບສະໜູນກົນໄກການຈັດປະເພດທາງເລືອກທີ່ຂັບເຄື່ອນໂດຍການຈັດກຸ່ມໂປຣຕີນທີ່ອີງໃສ່ lipid ແລະ ການຍົກເວັ້ນສິນຄ້າອື່ນໆຕໍ່ມາ. ການສັງເກດການຂອງພວກເຮົາຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າພາກພື້ນ ຫຼື ກຸ່ມ Gas1-GFP ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ ERES ສະເພາະຂາດໂປຣຕີນທີ່ປ່ອຍອອກມາຈາກເຍື່ອຫຸ້ມເຊລ Mid2-iRFP, ເຊິ່ງຊີ້ບອກວ່າກຸ່ມ GPI-AP ທີ່ຂຶ້ນກັບ ceramide ຂອງ C26 ຈະອໍານວຍຄວາມສະດວກໃນການເຂົ້າໄປໃນ ERES ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງ, ແລະໃນເວລາດຽວກັນ, ຍົກເວັ້ນສານຄັດຫຼັ່ງເຂົ້າໄປໃນ ERES ສະເພາະນີ້ (ຮູບທີ 1 ແລະ 2). ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, ການມີ ceramide C18-C16 ໃນເຍື່ອຫຸ້ມເຊລ ER ບໍ່ໄດ້ເຮັດໃຫ້ GPI-AP ສ້າງພາກພື້ນ ຫຼື ກຸ່ມ, ດັ່ງນັ້ນພວກມັນຈຶ່ງບໍ່ໄດ້ຍົກເວັ້ນ ຫຼື ທົດແທນໂປຣຕີນທີ່ປ່ອຍອອກມາຈາກເຍື່ອຫຸ້ມເຊລເຂົ້າໄປໃນ ERES ດຽວກັນ (ຮູບທີ 3 ແລະ 4). ດັ່ງນັ້ນ, ພວກເຮົາສະເໜີວ່າ C26 ceramide ຊ່ວຍກະຕຸ້ນການແຍກ ແລະ ການຈັດປະເພດໂດຍການອຳນວຍຄວາມສະດວກໃຫ້ແກ່ການຈັດກຸ່ມຂອງໂປຣຕີນທີ່ເຊື່ອມໂຍງກັບ ERES ສະເພາະ.
ວິທີການບັນລຸການຈັດກຸ່ມທີ່ຂຶ້ນກັບ ceramide ຂອງ C26 ນີ້ເຂົ້າໄປໃນພື້ນທີ່ ER ສະເພາະ? ແນວໂນ້ມຂອງ ceramide ຂອງເຍື່ອຫຸ້ມເຊຣາໄມດ໌ທີ່ຈະແຍກອອກຈາກກັນທາງຂ້າງອາດເຮັດໃຫ້ GPI-AP ແລະ C26 ceramide ສ້າງ lipids ຂະໜາດນ້ອຍ ແລະ ເປັນລະບຽບທັນທີໃນສະພາບແວດລ້ອມ lipid ທີ່ບໍ່ສະໝໍ່າສະເໝີຂອງເຍື່ອຫຸ້ມເຊຣາໄມດ໌ ER ທີ່ມີ glycerolipids ທີ່ສັ້ນກວ່າ ແລະ ບໍ່ອີ່ມຕົວ. ກຸ່ມທີ່ມີຄຸນນະພາບ (17, 18). ກຸ່ມຊົ່ວຄາວຂະໜາດນ້ອຍເຫຼົ່ານີ້ສາມາດລວມເຂົ້າກັນເປັນກຸ່ມທີ່ໃຫຍ່ກວ່າ ແລະ ໝັ້ນຄົງກວ່າຫຼັງຈາກຜູກມັດກັບສະລັບສັບຊ້ອນ p24 (34). ສອດຄ່ອງກັບສິ່ງນີ້, ພວກເຮົາໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ C26 Gas1-GFP ຈຳເປັນຕ້ອງພົວພັນກັບສະລັບສັບຊ້ອນ p24 ເພື່ອສ້າງກຸ່ມທີ່ເຫັນໄດ້ຂະໜາດໃຫຍ່ກວ່າ (ຮູບທີ 3). ສະລັບສັບຊ້ອນ p24 ແມ່ນ oligomer heterozygous ທີ່ປະກອບດ້ວຍໂປຣຕີນ transmembrane p24 ສີ່ຊະນິດທີ່ແຕກຕ່າງກັນໃນເຊື້ອລາ (35), ເຊິ່ງໃຫ້ການຜູກມັດຫຼາຍວາເລນ, ເຊິ່ງສາມາດນຳໄປສູ່ການເຊື່ອມໂຍງຂອງກຸ່ມ GPI-AP ຂະໜາດນ້ອຍ, ດັ່ງນັ້ນຈຶ່ງສ້າງກຸ່ມທີ່ໝັ້ນຄົງທີ່ໃຫຍ່ກວ່າ (34). ການພົວພັນລະຫວ່າງໂປຣຕີນ ectodomains ຂອງ GPI-APs ອາດຈະປະກອບສ່ວນເຂົ້າໃນການລວມຕົວຂອງພວກມັນ, ດັ່ງທີ່ສະແດງໃຫ້ເຫັນໃນລະຫວ່າງການຂົນສົ່ງ Golgi ຂອງພວກມັນໃນຈຸລັງ epithelial ທີ່ມີຂົ້ວຂອງສັດລ້ຽງລູກດ້ວຍນົມ (36). ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ເມື່ອ C18-C16 ceramide ມີຢູ່ໃນເຍື່ອ ER, ເມື່ອສະລັບສັບຊ້ອນ p24 ຜູກມັດກັບ Gas1-GFP, ກຸ່ມແຍກຕ່າງຫາກຂະໜາດໃຫຍ່ຈະບໍ່ຖືກສ້າງຂຶ້ນ. ກົນໄກທີ່ຕິດພັນອາດຈະຂຶ້ນກັບຄຸນສົມບັດທາງກາຍະພາບ ແລະ ເຄມີສະເພາະຂອງ ceramide ລະບົບຕ່ອງໂສ້ acyl ຍາວ. ການສຶກສາທາງຊີວະຟີຊິກຂອງເຍື່ອທຽມສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າເຖິງແມ່ນວ່າທັງ ceramide ລະບົບຕ່ອງໂສ້ acyl ຍາວ (C24) ແລະສັ້ນ (C18-C16) ສາມາດເຮັດໃຫ້ເກີດການແຍກໄລຍະ, ແຕ່ມີພຽງແຕ່ ceramide ລະບົບຕ່ອງໂສ້ acyl ຍາວ (C24) ເທົ່ານັ້ນທີ່ສາມາດສົ່ງເສີມຄວາມໂຄ້ງສູງ ແລະ ການງໍຂອງຟິມເພື່ອສ້າງຮູບຮ່າງຟິມໃໝ່. ຜ່ານການອ້າງອີງເຊິ່ງກັນແລະກັນ (17, 37, 38). ມັນໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ helix transmembrane ຂອງ TMED2, homologue ຂອງມະນຸດຂອງ Emp24, ມີປະຕິກິລິຍາເລືອກເຟັ້ນກັບ sphingomyelin ທີ່ອີງໃສ່ ceramide C18 ໃນ lobules cytoplasmic (39). ໂດຍການນໍາໃຊ້ການຈໍາລອງ molecular dynamics (MD), ພວກເຮົາພົບວ່າທັງ ceramides C18 ແລະ C26 ສະສົມຢູ່ອ້ອມຮອບ lobules cytoplasmic ຂອງ helix transmembrane Emp24, ແລະພວກມັນມີຄວາມມັກທີ່ຄ້າຍຄືກັນ (ຮູບ S6). ມັນເປັນມູນຄ່າທີ່ສັງເກດວ່ານີ້ຊີ້ບອກວ່າ helix transmembrane ຂອງ Emp24 ສາມາດນໍາໄປສູ່ການແຈກຢາຍ lipids ທີ່ບໍ່ສົມດຸນໃນເຍື່ອຫຸ້ມຈຸລັງ. ນີ້ແມ່ນຜົນໄດ້ຮັບທີ່ຜ່ານມາໂດຍອີງໃສ່ຈຸລັງສັດລ້ຽງລູກດ້ວຍນົມ. ການຈໍາລອງ MD ທີ່ຄ້າຍຄືກັນຍັງສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງການມີ lipids ether (40). ດັ່ງນັ້ນ, ພວກເຮົາຄາດຄະເນວ່າ ceramide C26 ໃນສອງ lobules ຂອງ ER26 ແມ່ນອຸດົມສົມບູນໃນທ້ອງຖິ່ນ. ເມື່ອ GPI-AP ໃນ lobules luminal ຜູກມັດໂດຍກົງກັບ p24 ຫຼາຍ valent ແລະ ການສະສົມຂອງ C26 ceramide ອ້ອມຮອບ p24 ໃນ lobules cytoplasmic, ມັນສາມາດສົ່ງເສີມການລວມຕົວຂອງໂປຣຕີນ ແລະ ຄວາມໂຄ້ງຂອງເຍື່ອຫຸ້ມເຊລຖືກສ້າງຂຶ້ນຜ່ານນິ້ວມື (41), ເຮັດໃຫ້ GPI-AP ແຍກອອກເປັນພາກພື້ນແຍກຕ່າງຫາກທີ່ຢູ່ຕິດກັບ ERES, ເຊິ່ງຍັງເອື້ອອຳນວຍໃຫ້ແກ່ພາກພື້ນທີ່ໂຄ້ງສູງຂອງເຍື່ອຫຸ້ມເຊລ ER (42). ບົດລາຍງານກ່ອນໜ້ານີ້ສະໜັບສະໜູນກົນໄກທີ່ສະເໜີ (43, 44). ການຜູກມັດຫຼາຍ oligolectins, ເຊື້ອພະຍາດ ຫຼື ພູມຕ້ານທານກັບ glycosphingolipids (GSL) ທີ່ອີງໃສ່ ceramide ໃນເຍື່ອຫຸ້ມເຊລມາກະຕຸ້ນການລວມຕົວ GSL ຂະໜາດໃຫຍ່, ເພີ່ມການແຍກໄລຍະ ແລະ ເຮັດໃຫ້ເຍື່ອຫຸ້ມເຊລຜິດຮູບ ແລະ ການພາຍໃນ (44). Iwabuchi ແລະອື່ນໆ (43) ພົບວ່າໃນເວລາທີ່ມີຕ່ອງໂສ້ acyl ຍາວ (C24) ແຕ່ບໍ່ສັ້ນ (C16), ລີແກນຫຼາຍວາເລນທີ່ຜູກມັດກັບ GSL lactosylceramide ເຮັດໃຫ້ເກີດການສ້າງກຸ່ມໃຫຍ່ ແລະ ການບຸກລຸກຂອງເຍື່ອຫຸ້ມເຊລ, ແລະ ການສົ່ງສັນຍານໂດຍ Lyn ໃນ cytoplasm ໃນໃບຍ່ອຍແມ່ນຖືກເຊື່ອມຕໍ່ກັນໂດຍຕ່ອງໂສ້ acyl ໃນ neutrophils ທີ່ເຊື່ອມຕໍ່ກັນ.
ໃນຈຸລັງ epithelial ທີ່ມີຂົ້ວຂອງສັດລ້ຽງລູກດ້ວຍນົມແມ່, ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງເຄືອຂ່າຍ anti-Golgi (TGN) ໃນລະດັບຂອງເຍື່ອຫຸ້ມຈຸລັງ apical ຄວບຄຸມການແຍກ ແລະ ການຈັດລຽງຂອງ GPI-AP (10, 45). ການລວມຕົວນີ້ແມ່ນຂັບເຄື່ອນໂດຍ oligomerization ຂອງ GPI-AP (36), ແຕ່ມັນອາດຈະຂຶ້ນກັບຄວາມຍາວຂອງລະບົບຕ່ອງໂສ້ ceramide ທີ່ພວກເຮົາພົບໃນເຊື້ອລາ. ເຖິງແມ່ນວ່າ GPI-AP ຂອງສັດລ້ຽງລູກດ້ວຍນົມແມ່ມີຈຸດຍຶດທີ່ອີງໃສ່ lipid ຂອງອີເທີ, ແລະໂຄງສ້າງທາງເຄມີຂອງມັນແຕກຕ່າງຈາກ ceramide ຂອງລະບົບຕ່ອງໂສ້ acyl ທີ່ຍາວຫຼາຍ, ການສຶກສາທີ່ຜ່ານມາພົບວ່າ lipid ທັງສອງມີຄຸນສົມບັດທາງກາຍະພາບ ແລະ ເຄມີທີ່ຄ້າຍຄືກັນທາງດ້ານວິວັດທະນາການ (40). ດັ່ງນັ້ນ, ສ່ວນ lipid ຂອງອີເທີໃນຈຸລັງສັດລ້ຽງລູກດ້ວຍນົມແມ່ອາດຈະຄ້າຍຄືກັບ ceramide C26 ໃນເຊື້ອລາ, ແລະບົດບາດຂອງມັນແມ່ນເພື່ອເຊື່ອມໂຍງກັບ ceramide ລະບົບຕ່ອງໂສ້ຍາວໃນເຍື່ອຫຸ້ມຈຸລັງເພື່ອສົ່ງເສີມການລວມຕົວ ແລະ ການຈັດລຽງຂອງ GPI-AP. ເຖິງແມ່ນວ່າຄວາມເປັນໄປໄດ້ນີ້ຍັງຕ້ອງໄດ້ຮັບການທົດສອບໂດຍກົງ, ແຕ່ການຄົ້ນພົບກ່ອນໜ້ານີ້ສະໜັບສະໜູນວ່າການຂົນສົ່ງຂອງເຊຣາໄມດ໌ຕ່ອງໂສ້ອາຊິວທີ່ຍາວໄປຫາຮ່າງກາຍ Golgi ບໍ່ໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໂປຣຕີນການໂອນຍ້າຍໄຊໂຕພລາສຕິກ, ແຕ່ຂຶ້ນກັບການສັງເຄາະຂອງຕົວຍຶດ GPI ເຊັ່ນເຊື້ອລາ. ດັ່ງນັ້ນ, ກົນໄກອະນຸລັກວິວັດທະນາການເບິ່ງຄືວ່າສາມາດຂົນສົ່ງເຊຣາໄມດ໌ຕ່ອງໂສ້ອາຊິວທີ່ຍາວຫຼາຍ ແລະ GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) ຮ່ວມກັນຢ່າງເລືອກເຟັ້ນໃນຖົງຂົນສົ່ງດຽວກັນ.
ໃນລະບົບຈຸລັງ epithelial ທີ່ມີຂົ້ວຂອງເຊື້ອລາ ແລະ ສັດລ້ຽງລູກດ້ວຍນົມແມ່, ການລວມຕົວ ແລະ ການແຍກ GPI-AP ຈາກໂປຣຕີນເຍື່ອຫຸ້ມຈຸລັງອື່ນໆທັງໝົດເກີດຂຶ້ນກ່ອນທີ່ຈະໄປເຖິງໜ້າຜິວຂອງຈຸລັງ. Paladino ແລະ ເພື່ອນຮ່ວມງານ (48) ພົບວ່າໃນ TGN ຂອງຈຸລັງ epithelial ທີ່ມີຂົ້ວຂອງສັດລ້ຽງລູກດ້ວຍນົມແມ່, ການຈັດກຸ່ມ GPI-AP ບໍ່ພຽງແຕ່ຈຳເປັນສຳລັບການຈັດປະເພດທີ່ເລືອກເຟັ້ນຂອງ GPI-APs ໃຫ້ກັບເຍື່ອຫຸ້ມຈຸລັງປາຍເທົ່ານັ້ນ, ແຕ່ຍັງຄວບຄຸມການຈັດກຸ່ມຂອງ GPI-APs ແລະ ກິດຈະກຳທາງຊີວະພາບຂອງມັນ. ໜ້າຜິວຂອງຈຸລັງ. ໃນເຊື້ອລາ, ການສຶກສານີ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າກຸ່ມ GPI-AP ທີ່ຂຶ້ນກັບ ceramide C26 ໃນ ER ສາມາດຄວບຄຸມການຈັດກຸ່ມ ແລະ ກິດຈະກຳການເຮັດວຽກຂອງ GPI-AP ໃນເຍື່ອຫຸ້ມຈຸລັງ (24, 49). ສອດຄ່ອງກັບຮູບແບບນີ້, ຈຸລັງ GhLag1 ມີອາການແພ້ຕໍ່ຕົວຍັບຍັ້ງ GPI ຫຼື ຢາທີ່ມີຜົນກະທົບຕໍ່ຄວາມສົມບູນຂອງຝາຈຸລັງ (28), ແລະ ຄວາມຕ້ອງການກຸ່ມ Gas1-GFP ທີ່ເຮັດວຽກໄດ້ (49) ຂອງ ceramide ປາຍທີ່ສະແດງໃນການຈັບຄູ່ຂອງຈຸລັງເຊື້ອລາຊີ້ບອກເຖິງ G​ ຜົນສະທ້ອນທາງສະລີລະວິທະຍາທີ່ເປັນໄປໄດ້ຂອງຈຸລັງ hLag1. ຄວາມຜິດພາດ GPI-AP. ເຖິງຢ່າງໃດກໍ່ຕາມ, ການທົດສອບຕື່ມອີກວ່າການຈັດລະບຽບໜ້າທີ່ຂອງໜ້າດິນຂອງເຊລໄດ້ຖືກຂຽນໂປຣແກຣມຈາກ ER ໂດຍວິທີການຈັດຮຽງໂດຍອີງໃສ່ຄວາມຍາວຂອງໄຂມັນຈະເປັນຫົວຂໍ້ຂອງການຄົ້ນຄວ້າໃນອະນາຄົດຂອງພວກເຮົາ.
ເຊື້ອ Saccharomyces cerevisiae ທີ່ໃຊ້ໃນວຽກງານນີ້ແມ່ນໄດ້ລະບຸໄວ້ໃນຕາຕະລາງ S1. ເຊື້ອ MMY1583 ແລະ MMY1635 ຂອງ SCLIM ສຳລັບການຖ່າຍພາບຈຸລັງທີ່ມີຊີວິດໄດ້ຖືກສ້າງຂຶ້ນໃນພື້ນຫລັງຂອງ W303. ເຊື້ອເຫຼົ່ານີ້ທີ່ສະແດງອອກ Sec13-mCherry ດ້ວຍປ້າຍໂປຣຕີນ fluorescent ໄດ້ຖືກສ້າງຂຶ້ນໂດຍໃຊ້ວິທີການທີ່ອີງໃສ່ປະຕິກິລິຍາລະບົບຕ່ອງໂສ້ໂພລີເມີເຣສ (PCR) ທີ່ມີພລາສມິດ pFA6a ເປັນແມ່ແບບ (23). ເຊື້ອທີ່ສະແດງອອກ Mid2-iRFP ທີ່ຕິດປ້າຍດ້ວຍໂປຣຕີນ fluorescent ພາຍໃຕ້ການຄວບຄຸມຂອງໂປຣໂມເຕີ GAL1 ໄດ້ຖືກສ້າງຂຶ້ນດັ່ງຕໍ່ໄປນີ້. ການຂະຫຍາຍ PCR ຂອງລຳດັບ iRFP-KanMx ຈາກເວັກເຕີ pKTiRFP-KAN (ຂອງຂວັນຂອງ E. O'Shea, ໝາຍເລກພລາສມິດ Addgene 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; ຕົວລະບຸຊັບພະຍາກອນການຄົ້ນຄວ້າ (RRID): Addgene_64687) ແລະຖືກໃສ່ເຂົ້າໄປໃນ C-terminus ຂອງ Mid2 ພາຍໃນ. ຫຼັງຈາກລຳດັບຈີໂນມ Mid2-iRFP ໄດ້ຖືກຂະຫຍາຍ ແລະ ໂຄນເຂົ້າໄປໃນໂປຣໂມເຕີ GAL1, ມັນໄດ້ຖືກລວມເຂົ້າກັບສະຖານທີ່ Not I-Sac I ຂອງພລາສມິດລວມ pRS306. ພລາສມິດ pRGS7 ທີ່ໄດ້ຮັບໄດ້ຖືກເຮັດໃຫ້ເປັນເສັ້ນຊື່ກັບ Pst I ເພື່ອລວມເຂົ້າກັບສະຖານທີ່ URA3.
ຍີນຟິວຊັນ Gas1-GFP ຖືກສະແດງອອກພາຍໃຕ້ການຄວບຄຸມຂອງໂປຣໂມເຕີ GAL1 ໃນ centromere (CEN), ເຊິ່ງຖືກສ້າງຂຶ້ນດັ່ງຕໍ່ໄປນີ້. ລຳດັບ Gas1-GFP ໄດ້ຖືກຂະຫຍາຍໂດຍ PCR ຈາກ plasmid pRS416-GAS1-GFP (24) (ຂອງຂວັນຂອງ L. Popolo) ແລະໂຄນເຂົ້າໄປໃນສະຖານທີ່ Xma I–Xho I ຂອງ plasmid CEN pBEVY-GL LEU2 (ຂອງຂວັນຂອງ C). Miller; ໝາຍເລກ plasmid Addgene 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). plasmid ທີ່ໄດ້ຮັບມີຊື່ວ່າ pRGS6. ຍີນຟິວຊັນ Axl2-GFP ຍັງຖືກສະແດງອອກພາຍໃຕ້ການຄວບຄຸມຂອງໂປຣໂມເຕີ GAL1 ຂອງເວັກເຕີ pBEVY-GL LEU2, ແລະໂຄງສ້າງຂອງມັນມີດັ່ງຕໍ່ໄປນີ້. ລຳດັບ Axl2-GFP ໄດ້ຖືກຂະຫຍາຍຈາກພລາສມິດ pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) ໂດຍ PCR, ແລະໂຄນເຂົ້າໄປໃນສະຖານທີ່ Bam HI-Pst I ຂອງເວັກເຕີ pBEVY-GL LEU2. ພລາສມິດທີ່ໄດ້ຮັບແມ່ນມີຊື່ວ່າ pRGS12. ລຳດັບຂອງໂອລິໂກນິວຄລີໂອໄທດ໌ທີ່ໃຊ້ໃນການສຶກສານີ້ແມ່ນລະບຸໄວ້ໃນຕາຕະລາງ S2.
ເຊື້ອພັນດັ່ງກ່າວໄດ້ຮັບການເສີມດ້ວຍ adenine 0.2% ແລະ glucose 2% [YP-dextrose (YPD)], ສານສະກັດຈາກເຊື້ອລາທີ່ອຸດົມດ້ວຍ raffinose 2% [YP-raffinose] ໂປຣຕີນ p (YP) ສື່ກາງ (ສານສະກັດຈາກເຊື້ອລາ 1% ແລະໂປຣຕີນ ept 2%). (YPR)] ຫຼື galactose 2% [YP-galactose (YPG)] ເປັນແຫຼ່ງຄາບອນ, ຫຼືໃນສື່ກາງສັງເຄາະຂັ້ນຕ່ຳ (ຖານໄນໂຕຣເຈນເຊື້ອລາ 0.15% ແລະ ammonium sulfate 0.5%) ເພື່ອເສີມກົດອະມິໂນ ແລະ ພື້ນຖານທີ່ເໝາະສົມທີ່ຕ້ອງການສຳລັບໂພຊະນາການ, ແລະ ປະກອບດ້ວຍ glucose 2% (ສື່ກາງສັງເຄາະຂັ້ນຕ່ຳ) ຫຼື galactose 2% (ສື່ກາງສັງເຄາະຂັ້ນຕ່ຳ) ເປັນແຫຼ່ງຄາບອນ.
ສຳລັບການຖ່າຍພາບແບບເວລາຈິງ, ຈຸລັງກາຍພັນ sec31-1 ທີ່ມີຄວາມອ່ອນໄຫວຕໍ່ອຸນຫະພູມ ເຊິ່ງສະແດງອອກພາຍໃຕ້ໂປຣໂມເຕີ GAL1 ໄດ້ຖືກປູກໃນສື່ກາງ YPR ທີ່ອຸນຫະພູມ 24°C ຕະຫຼອດຄືນຈົນເຖິງໄລຍະກາງຂອງລະບົບ. ຫຼັງຈາກການກະຕຸ້ນໃນ YPG ທີ່ອຸນຫະພູມ 24°C ເປັນເວລາ 1 ຊົ່ວໂມງ, ຈຸລັງໄດ້ຖືກບົ່ມໃນ SG ທີ່ອຸນຫະພູມ 37°C ເປັນເວລາ 30 ນາທີ, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນຍ້າຍໄປທີ່ 24°C ເພື່ອປ່ອຍອອກຈາກບລັອກການຫຼั่ง. Concanavalin A ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອຕິດຈຸລັງໃສ່ແຜ່ນສະໄລ້ແກ້ວ ແລະ ຖ່າຍພາບໂດຍ SCLIM. SCLIM ແມ່ນການລວມກັນຂອງກ້ອງຈຸລະທັດຟລູອໍເຣສເຊັນສ໌ແບບປີ້ນກັບຂອງ Olympus IX-71 ແລະເລນນ້ຳມັນຮູຮັບແສງ UPlanSApo 100×1.4 (Olympus), ເຄື່ອງສະແກນແຜ່ນໝຸນທີ່ມີຄວາມໄວສູງ ແລະ ອັດຕາສ່ວນສັນຍານຕໍ່ສຽງລົບກວນສູງ (Yokogawa Electric), ເຄື່ອງວັດແທກແສງແບບກຳນົດເອງ, ແລະ ເຄື່ອງເຮັດຄວາມເຢັນແບບກຳນົດເອງ. ຕົວເພີ່ມຄວາມເຂັ້ມຂອງຮູບພາບຂອງລະບົບ (Hamamatsu Photonics) ສາມາດສະໜອງລະບົບເລນຂະຫຍາຍທີ່ມີການຂະຫຍາຍສຸດທ້າຍຂອງ ×266.7 ແລະ ກ້ອງຖ່າຍຮູບອຸປະກອນຄູ່ປະຈຸທີ່ຄູນເອເລັກຕຣອນ (Hamamatsu Photonics) (21). ການໄດ້ຮູບພາບແມ່ນປະຕິບັດໂດຍຊອບແວທີ່ກຳນົດເອງ (Yokogawa Electric). ສຳລັບຮູບພາບ 3D, ພວກເຮົາໄດ້ໃຊ້ຕົວກະຕຸ້ນ piezoelectric ທີ່ກຳນົດເອງເພື່ອສັ່ນເລນວັດຖຸໃນແນວຕັ້ງ, ແລະ ເກັບກຳຊິ້ນສ່ວນທາງ optical ອອກຈາກກັນ 100 nm ໃນ stack. ຮູບພາບ Z-stack ຖືກປ່ຽນເປັນຂໍ້ມູນ voxel 3D, ແລະ ຟັງຊັນການກະຈາຍຈຸດທາງທິດສະດີທີ່ໃຊ້ສຳລັບກ້ອງຈຸລະທັດແຜ່ນໝຸນແມ່ນໃຊ້ສຳລັບການປະມວນຜົນ deconvolution ໂດຍຊອບແວ Volocity (PerkinElmer). ໂດຍການໃຊ້ຊອບແວ Volocity ເພື່ອກຳນົດຄ່າອັດຕະໂນມັດສຳລັບການວິເຄາະສະຖານທີ່ຮ່ວມກັນ, ERES ລວມທັງສິນຄ້າໄດ້ຖືກວັດແທກ. ການວິເຄາະການສະແກນເສັ້ນໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ຊອບແວ MetaMorph (ອຸປະກອນໂມເລກຸນ).
ໃຊ້ຊອບແວ GraphPad Prism ເພື່ອກຳນົດຄວາມສຳຄັນທາງສະຖິຕິ. ສຳລັບການທົດສອບ t ຂອງນັກສຶກສາສອງຫາງ ແລະ ການທົດສອບການວິເຄາະຄວາມແปรປ່ວນທາງດຽວ (ANOVA), ຄວາມແຕກຕ່າງລະຫວ່າງກຸ່ມຕ່າງໆຖືວ່າມີຜົນກະທົບຢ່າງຫຼວງຫຼາຍຕໍ່ P <0.05 (*).
ສຳລັບກ້ອງຈຸລະທັດ fluorescence ຂອງ Gas1-GFP, ຈຸລັງໄລຍະ log ໄດ້ຖືກປູກຄ້າງຄືນໃນ YPD ແລະເກັບກຳໂດຍການ centrifuge, ລ້າງສອງຄັ້ງດ້ວຍນ້ຳເຄັມ phosphate buffered, ແລະ ບົ່ມໃສ່ນ້ຳກ້ອນຢ່າງໜ້ອຍ 15 ນາທີ, ແລະ ຫຼັງຈາກນັ້ນດຳເນີນການພາຍໃຕ້ກ້ອງຈຸລະທັດຕາມທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ກ່ອນໜ້ານີ້ Check (24). ກ້ອງຈຸລະທັດ Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) ທີ່ມີເລນວັດຖຸ, ຕົວກອງ L5 (GFP), ກ້ອງຖ່າຍຮູບ Hamamatsu ແລະ ຊອບແວ Application Suite X (LAS X) ໄດ້ຖືກນຳໃຊ້ເພື່ອການເກັບກຳ.
ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກປ່ຽນສະພາບດ້ວຍບັຟເຟີຕົວຢ່າງ SDS ທີ່ 65°C ເປັນເວລາ 10 ນາທີ, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນແຍກອອກໂດຍ SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). ສຳລັບການວິເຄາະ immunoblotting, ຕົວຢ່າງ 10 μl ໄດ້ຖືກໂຫຼດຕໍ່ເລນ. ພູມຕ້ານທານຂັ້ນຕົ້ນ: ໃຊ້ rabbit polyclonal anti-Gas1 ໃນຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ 1:3000, rabbit polyclonal anti-Emp24 ໃນຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ 1:500, ແລະ rabbit polyclonal anti-GFP (ຂອງຂວັນຈາກ H. Riezman) ໃນຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ 1:3000. ພູມຕ້ານທານ monoclonal anti-Pgk1 ຂອງໜູຖືກນຳໃຊ້ໃນຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ 1:5000 (ຂອງຂວັນຈາກ J. de la Cruz). ພູມຕ້ານທານຂັ້ນສອງ: Horseradish peroxidase (HRP) conjugated goat anti-rabbit immunoglobulin G (IgG) ທີ່ໃຊ້ໃນຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ 1:3000 (Pierce). ການໃຊ້ HRP-conjugated goat anti-mouse IgG ທີ່ໃຊ້ໃນການລະລາຍ 1:3000 (Pierce). ເຂດຕອບສະໜອງຂອງພູມຕ້ານທານໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນໂດຍວິທີການ chemiluminescence ຂອງ SuperSignal West Pico reagent (Thermo Fisher Scientific).
ດັ່ງທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ໃນ (31), ການທົດລອງ immunoprecipitation ຕາມທຳມະຊາດໄດ້ຖືກປະຕິບັດໃນສ່ວນປະກອບ ER ທີ່ເສີມ. ໂດຍຫຍໍ້, ລ້າງຈຸລັງເຊື້ອລາດ້ວຍບັຟເຟີ TNE [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride ແລະສ່ວນປະສົມຂອງ protease inhibitor) ທີ່ 600 nm (OD600) ທີ່ຄວາມໜາແໜ້ນທາງ optical 100 ສອງຄັ້ງ. ມັນຖືກທຳລາຍດ້ວຍລູກປັດແກ້ວ, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນເສດຈຸລັງ ແລະ ລູກປັດແກ້ວໄດ້ຖືກກຳຈັດອອກໂດຍການ centrifuge. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, supernatant ໄດ້ຖືກ centrifuge ທີ່ 17,000 g ເປັນເວລາ 15 ນາທີທີ່ 4°C. pellet ໄດ້ຖືກລະລາຍຄືນໃໝ່ໃນ TNE ແລະ digitalis saponin ໄດ້ຖືກເພີ່ມເຂົ້າໃນຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນສຸດທ້າຍ 1%. ສານລະລາຍໄດ້ຖືກບົ່ມເປັນເວລາ 1 ຊົ່ວໂມງດ້ວຍການໝຸນທີ່ 4°C, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນສ່ວນປະກອບທີ່ບໍ່ລະລາຍໄດ້ຖືກກຳຈັດອອກໂດຍການ centrifuge ທີ່ 13,000 g ທີ່ 4°C ເປັນເວລາ 60 ນາທີ. ສຳລັບການກວດ immunoprecipitation ຂອງ Gas1-GFP, ກ່ອນອື່ນໝົດໃຫ້ບົ່ມຕົວຢ່າງດ້ວຍລູກປັດ agarose ທີ່ຫວ່າງເປົ່າ (ChromoTek) ທີ່ອຸນຫະພູມ 4°C ເປັນເວລາ 1 ຊົ່ວໂມງ, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນໃຫ້ບົ່ມດ້ວຍ GFP-Trap_A (ChromoTek) ທີ່ອຸນຫະພູມ 4°C ເປັນເວລາ 3 ຊົ່ວໂມງ. ລູກປັດທີ່ຖືກກວດ immunoprecipitation ໄດ້ຖືກລ້າງຫ້າຄັ້ງດ້ວຍ TNE ທີ່ມີ digoxigenin 0.2%, eled ດ້ວຍ buffer ຕົວຢ່າງ SDS, ແຍກອອກໃນ SDS-PAGE, ແລະວິເຄາະໂດຍ immunoblotting.
ດັ່ງທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ໃນ (31), ການກຳນົດການເຊື່ອມໂຍງໄດ້ຖືກປະຕິບັດໃນສ່ວນປະກອບ ER ທີ່ເສີມ. ໂດຍຫຍໍ້, ສ່ວນປະກອບ ER ທີ່ເສີມໄດ້ຖືກບົ່ມດ້ວຍ 0.5 mM dithiobis(succinimidyl propionate) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 ນາທີ). ປະຕິກິລິຍາການເຊື່ອມໂຍງໄດ້ຖືກດັບລົງໂດຍການເພີ່ມ glycine (ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນສຸດທ້າຍ 50 mM, 5 ນາທີ, 20°C).
ດັ່ງທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ກ່ອນໜ້ານີ້ (50), ການວິເຄາະ MS ຂອງ ceramide ໃນເຊື້ອພັນ wild-type ແລະ GhLag1 ໄດ້ຖືກປະຕິບັດ. ສະຫຼຸບແລ້ວ, ຈຸລັງໄດ້ຖືກປູກໄປສູ່ໄລຍະ exponential (3 ຫາ 4 OD600 ໜ່ວຍ/ml) ໃນ YPD ທີ່ 30°C, ແລະ ຈຸລັງ 25 × 107 ໄດ້ຖືກເກັບກ່ຽວ. ການເຜົາຜານອາຫານຂອງພວກມັນຖືກດັບດ້ວຍກົດ trichloroacetic. ໃຊ້ຕົວລະລາຍສະກັດ [ເອທານອນ, ນ້ຳ, ອີເທີ, pyridine ແລະ 4.2 N ammonium hydroxide (15:15:5:1:0.018 v/v)] ແລະ 1.2 nmol ຂອງມາດຕະຖານພາຍໃນ C17 ceramide (860517, Avanti polar lipid) ຄຸນນະພາບ). ໃຊ້ສານ monomethylamine [methanol, ນ້ຳ, n-butanol ແລະ ສານລະລາຍ methylamine (4:3:1:5 v/v)] ເພື່ອປະຕິບັດການ hydrolysis ດ່າງອ່ອນໆຂອງສານສະກັດ, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນໃຊ້ n-butanol ທີ່ອີ່ມຕົວດ້ວຍນ້ຳເພື່ອ desalt. ສຸດທ້າຍ, ສານສະກັດໄດ້ຖືກລະລາຍຄືນໃໝ່ໃນຕົວລະລາຍໂໝດບວກ [ຄລໍໂຣຟອມ/ເມທານອນ/ນ້ຳ (2:7:1) + 5 mM ແອມໂມນຽມອາເຊເຕດ] ແລະ ສີດເຂົ້າໄປໃນເຄື່ອງວັດແທກມວນສານ. ການຕິດຕາມກວດກາຫຼາຍປະຕິກິລິຍາ (MRM) ໄດ້ຖືກປະຕິບັດເພື່ອການກຳນົດ ແລະ ການວັດແທກປະລິມານຂອງໂມເລກຸນສະຟິງໂກລີປິດ. ເຄື່ອງວັດແທກມວນສານ TSQ Vantage tertiary quadrupole (Thermo Fisher Scientific) ແມ່ນຕິດຕັ້ງດ້ວຍແຫຼ່ງໄອອອນ nanoflow ຫຸ່ນຍົນ Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) ສຳລັບການວິເຄາະໄຂມັນ. ພະລັງງານການຊົນກັນໄດ້ຖືກປັບປຸງໃຫ້ດີທີ່ສຸດສຳລັບແຕ່ລະໝວດໝູ່ເຊຣາໄມ. ຂໍ້ມູນ MS ໄດ້ຮັບໃນຮູບແບບບວກ. ສຳລັບແຕ່ລະການຊ້ຳຊ້ອນທາງຊີວະພາບ, ສັນຍານໄຂມັນແມ່ນຄ່າກາງຂອງການວັດແທກເອກະລາດສາມຢ່າງ.
ດັ່ງທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ໃນ (31), ຈຸລັງ (800 × 107) ທີ່ສະແດງອອກ Gas1-GFP ໄດ້ຖືກຮັບການຕົກຕະກອນທາງທຳມະຊາດ. Gas1-GFP ທີ່ບໍລິສຸດໄດ້ຖືກແຍກອອກໂດຍ SDS-PAGE ແລະໂອນໄປຫາເຍື່ອ polyvinylidene fluoride (PVDF). ໂປຣຕີນໄດ້ຖືກເບິ່ງເຫັນໂດຍການຍ້ອມສີ PVDF ດ້ວຍ amide black. ແຖບ Gas1-GFP ໄດ້ຖືກຕັດອອກຈາກ PVDF ແລະລ້າງ 5 ເທື່ອດ້ວຍ methanol ແລະອີກຄັ້ງໜຶ່ງດ້ວຍນ້ຳລະດັບ liquid chromatography-MS (LC-MS). ໂດຍການບົ່ມແຖບເຍື່ອດ້ວຍ 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), buffer ແລະສ່ວນປະສົມ sodium nitrite 1 M ທີ່ລະລາຍໃໝ່ໆ 500μl ທີ່ອຸນຫະພູມ 37°C ເປັນເວລາ 3 ຊົ່ວໂມງ, ສ່ວນ lipid ຈະຖືກປ່ອຍອອກຈາກ Gas1-GFP ແລະລະລາຍ. ການປ່ອຍ inosine phosphate ceramide ລະຫວ່າງ glucosamine ແລະ inositol (51). ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ແຖບເຍື່ອໄດ້ຖືກລ້າງສີ່ເທື່ອດ້ວຍນ້ຳເກຣດ LC-MS, ຕາກໃຫ້ແຫ້ງທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງ, ແລະເກັບຮັກສາໄວ້ໃນບັນຍາກາດໄນໂຕຣເຈນທີ່ -80°C ຈົນກ່ວາການວິເຄາະ. ໃນຖານະເປັນຕົວຄວບຄຸມ, ຕົວຢ່າງເປົ່າຂອງເຍື່ອ PVDF ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບແຕ່ລະການທົດລອງ. ໄຂມັນທີ່ສະກັດຈາກ Gas1-GFP ຫຼັງຈາກນັ້ນໄດ້ຖືກວິເຄາະໂດຍ MS ຕາມທີ່ໄດ້ອະທິບາຍ (50). ສະຫຼຸບແລ້ວ, ແຖບ PVDF ທີ່ມີ GPI-lipid ໄດ້ຖືກລະລາຍຄືນໃໝ່ໃນຕົວລະລາຍເຊື້ອລາລົບ 75μl [chloroform/methanol (1:2) + 5 mM ammonium acetate] ແລະຜ່ານການວິເຄາະ electrospray ionization (ESI)-MRM/MS ຂອງຊະນິດ sphingolipid (TSQ Vantage). ໃນກໍລະນີນີ້, ຂໍ້ມູນ MS ໄດ້ຮັບໃນຮູບແບບໄອອອນລົບ.
ດັ່ງທີ່ໄດ້ກ່າວມາກ່ອນໜ້ານີ້, ສ່ວນໄຂມັນຂອງຕົວຍຶດ GPI ໄດ້ຖືກແຍກອອກຈາກ GPI-AP ທີ່ຕິດສະຫຼາກ [3H]-inositol (16). ໄຂມັນໄດ້ຖືກແຍກອອກໂດຍໂຄຣມາໂຕກຣາຟີຊັ້ນບາງໂດຍໃຊ້ລະບົບຕົວລະລາຍ (55:45:10 chloroform-methanol-0.25% KCl) ແລະເບິ່ງເຫັນໂດຍໃຊ້ FLA-7000 (Fujifilm).
ຈຸລັງທີ່ສະແດງອອກ Gas1-GFP (600 × 107) ໄດ້ຖືກລ້າງສອງຄັ້ງດ້ວຍບັຟເຟີ TNE ດ້ວຍບັຟເຟີ TNE, ແລະ ທຳລາຍດ້ວຍລູກປັດແກ້ວ, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນ centrifuge ເພື່ອເອົາເສດຈຸລັງ ແລະ ລູກປັດແກ້ວອອກ. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ນ້ຳໃຕ້ຜິວໄດ້ຖືກ centrifuge ທີ່ 17,000 g ເປັນເວລາ 1 ຊົ່ວໂມງທີ່ 4°C. ເມັດໄດ້ຖືກລ້າງໃນ TNE ແລະ ບົ່ມດ້ວຍ 1 U PI-PLC (Invitrogen) ໃນ TNE ທີ່ມີ 0.2% digitalis saponin ເປັນເວລາ 1 ຊົ່ວໂມງທີ່ 37°C. ຫຼັງຈາກການປິ່ນປົວດ້ວຍ enzyme, ເຍື່ອຫຸ້ມໄດ້ຖືກກຳຈັດອອກໂດຍການ centrifuge ທີ່ 17,000 g ທີ່ 4°C ເປັນເວລາ 1 ຊົ່ວໂມງ. ເພື່ອສ້າງພູມຕ້ານທານໃຫ້ກັບ Gas1-GFP, ນ້ຳໃຕ້ຜິວໄດ້ຖືກບົ່ມດ້ວຍ GFP-Trap_A (ChromoTek) ທີ່ 4°C ຄ້າງຄືນ. Gas1-GFP ທີ່ບໍລິສຸດທີ່ແຍກອອກໂດຍ SDS-PAGE ໄດ້ຖືກຍ້ອມດ້ວຍສີຟ້າສົດໃສ Coomassie. ແຖບສີ Gas1-GFP ໄດ້ຖືກຕັດອອກຈາກສີເທົາທີ່ອ້ອມຮອບທໍ່ລະບາຍນ້ຳ, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນຫຼັງຈາກການ alkylation ກັບ iodoacetamide ແລະ reducion ດ້ວຍ dithiothreitol, ການຍ່ອຍສະຫຼາຍໃນເຈວດ້ວຍ trypsin ໄດ້ຖືກປະຕິບັດ. ສະກັດ ແລະ ແຫ້ງ peptides tryptic ແລະ peptides ດ້ວຍ GPI-glycans. peptide ແຫ້ງໄດ້ຖືກລະລາຍໃນນ້ຳ 20 μl. ສັກສ່ວນໜຶ່ງ (8μl) ເຂົ້າໄປໃນ LC. ຖັນ octadecylsilane (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; ເສັ້ນຜ່າສູນກາງພາຍໃນ 150 mm × 1.0 mm; Nomura Chemical, Aichi Prefecture, ຍີ່ປຸ່ນ) ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອແຍກ peptides ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂ gradient ສະເພາະ. ໄລຍະເຄື່ອນທີ່ແມ່ນຕົວລະລາຍ A (ກົດ formic 0.08%) ແລະຕົວລະລາຍ B (ກົດ formic 0.15% ໃນ acetonitrile 80%). ລະບົບ Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອລະລາຍຖັນດ້ວຍຕົວລະລາຍ A ພາຍໃນ 55 ນາທີທີ່ອັດຕາການໄຫຼ 50 μl min-1 ເປັນເວລາ 5 ນາທີ, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງຕົວລະລາຍ B ໄດ້ເພີ່ມຂຶ້ນເປັນ 40%. (( ... ຂໍ້ມູນ MS ໄດ້ຮັບໃນຮູບແບບໄອອອນບວກ (ຄວາມລະອຽດ 60,000; ຄວາມຖືກຕ້ອງຂອງມວນສານ 10 ສ່ວນຕໍ່ລ້ານ) ໃນຊ່ວງມວນສານ 300/m/z ອັດຕາສ່ວນມວນສານ/ປະຈຸ (m/z) 3000. ຂໍ້ມູນ MS/MS ໄດ້ຮັບຜ່ານກັບດັກໄອອອນໃນ LTQ Orbitrap XL [3 ຕົວເລກທຳອິດທີ່ຂໍ້ມູນຂຶ້ນກັບ, ການແຍກຕົວທີ່ເກີດຈາກການປະທະກັນ (CID)].
ການຈຳລອງ MD ໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ຊອບແວ GROMACS (52) ແລະສະໜາມແຮງ MARTINI 2 (53-55). ຫຼັງຈາກນັ້ນ, CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອສ້າງຊັ້ນສອງຊັ້ນທີ່ມີ dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) ແລະ Cer C18 ຫຼື DOPC ແລະ Cer C26. topology ແລະພິກັດຂອງ Cer C26 ແມ່ນໄດ້ມາຈາກ DXCE ໂດຍການເອົາລູກປັດພິເສດອອກຈາກຫາງ sphingosine. ໃຊ້ຂະບວນການທີ່ໄດ້ອະທິບາຍຂ້າງລຸ່ມນີ້ເພື່ອດຸ່ນດ່ຽງຊັ້ນສອງຊັ້ນແລະດໍາເນີນການມັນ, ຫຼັງຈາກນັ້ນໃຊ້ພິກັດສຸດທ້າຍຂອງລະບົບເພື່ອສ້າງລະບົບທີ່ມີ Emp24. ໂດເມນ transmembrane ຂອງເຊື້ອລາ Emp24 (ສ່ວນທີ່ເຫຼືອ 173 ຫາ 193) ໄດ້ຖືກສ້າງຂຶ້ນເປັນ α-helix ໂດຍໃຊ້ໂຄງສ້າງໂມເລກຸນເຄື່ອງມື visual MD (VMD) (58). ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ຫຼັງຈາກເອົາ lipids ທີ່ຊ້ອນກັນອອກ, ໂປຣຕີນໄດ້ຖືກ granulated ຫຍາບແລະໃສ່ເຂົ້າໄປໃນຊັ້ນສອງຊັ້ນໂດຍໃຊ້ CHARMM GUI. ລະບົບສຸດທ້າຍປະກອບດ້ວຍ 1202 DOPC ແລະ 302 Cer C26 ຫຼື 1197 DOPC ແລະ 295 Cer C18 ແລະ Emp24. ປະສົມລະບົບໃຫ້ມີຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ 0.150 M. ມີການສຳເນົາເອກະລາດສີ່ອັນສຳລັບສອງອົງປະກອບສອງຊັ້ນ.
ຊັ້ນໄຂມັນສອງຊັ້ນຖືກດຸ່ນດ່ຽງໂດຍໃຊ້ຂະບວນການ CHARMM GUI, ເຊິ່ງກ່ຽວຂ້ອງກັບການຫຼຸດຜ່ອນ ແລະ ຫຼັງຈາກນັ້ນດຸ່ນດ່ຽງ 405,000 ຂັ້ນຕອນ, ບ່ອນທີ່ຂໍ້ຈຳກັດຂອງຕຳແໜ່ງຖືກຫຼຸດລົງ ແລະ ກຳຈັດອອກເທື່ອລະກ້າວ, ແລະ ຂັ້ນຕອນເວລາເພີ່ມຂຶ້ນຈາກ 0.005 ps ເປັນ 0.02 ps. ຫຼັງຈາກການດຸ່ນດ່ຽງ, ມັນຈະຜະລິດ 6 µs ດ້ວຍຂັ້ນຕອນເວລາ 0.02 ps. ຫຼັງຈາກໃສ່ Emp24, ໃຫ້ໃຊ້ຂະບວນການ CHARMM GUI ດຽວກັນເພື່ອຫຼຸດຜ່ອນ ແລະ ດຸ່ນດ່ຽງລະບົບ, ແລະ ຈາກນັ້ນດຳເນີນການຜະລິດເປັນເວລາ 8 ວິນາທີ.
ສຳລັບທຸກລະບົບ, ໃນລະຫວ່າງຂະບວນການດຸ່ນດ່ຽງ, ຄວາມດັນຈະຖືກຄວບຄຸມໂດຍເຄື່ອງວັດແທກຄວາມດັນ Berendsen (59), ແລະ ໃນລະຫວ່າງຂະບວນການຜະລິດ, ຄວາມດັນຈະຖືກຄວບຄຸມໂດຍເຄື່ອງວັດແທກຄວາມດັນ Parrinello-Rahman (60). ໃນທຸກໆກໍລະນີ, ຄວາມດັນສະເລ່ຍແມ່ນ 1 bar ແລະ ແຜນການຈັບຄູ່ຄວາມດັນເຄິ່ງ isotropic ຖືກນຳໃຊ້. ໃນຂະບວນການດຸ່ນດ່ຽງ ແລະ ການຜະລິດ, ເຄື່ອງຄວບຄຸມອຸນຫະພູມ (61) ທີ່ມີການປັບປຸງຄວາມໄວຄືນໃໝ່ຖືກນຳໃຊ້ເພື່ອຈັບຄູ່ອຸນຫະພູມຂອງໂປຣຕີນ, ໄຂມັນ ແລະ ອະນຸພາກຕົວລະລາຍຕາມລຳດັບ. ໃນລະຫວ່າງການດຳເນີນງານທັງໝົດ, ອຸນຫະພູມເປົ້າໝາຍແມ່ນ 310K. ການພົວພັນທີ່ບໍ່ມີພັນທະຖືກຄິດໄລ່ໂດຍການສ້າງລາຍຊື່ຄູ່ໂດຍໃຊ້ແຜນການ Verlet ທີ່ມີຄວາມທົນທານຂອງບັຟເຟີ 0.005. ຄ່າ Coulomb ຖືກຄິດໄລ່ໂດຍໃຊ້ພາກສະໜາມປະຕິກິລິຍາ ແລະ ໄລຍະຕັດ 1.1 nm. ຄ່າ Vander Waals ໃຊ້ແຜນການຕັດທີ່ມີໄລຍະຕັດ 1.1 nm, ແລະ ແຜນການຕັດ Verlet ຖືກນຳໃຊ້ສຳລັບການດຣິຟທີ່ອາດເກີດຂຶ້ນ (62).
ການໃຊ້ VMD, ຄວາມຍາວຄື້ນຕັດລະຫວ່າງລູກປັດ DOPC ຟອສເຟດ ຫຼື ລູກປັດ ceramide AM1 ແລະໂປຣຕີນແມ່ນ 0.7 nm, ແລະຈຳນວນໄຂມັນທີ່ພົວພັນກັບໂປຣຕີນໄດ້ຖືກຄິດໄລ່. ອີງຕາມສູດຕໍ່ໄປນີ້, ໃຫ້ຄິດໄລ່ຕົວຄູນ depletion-enrichment (DE) ຄືກັບໃນ (63): ຕົວຄູນ DE = (ປະລິມານໄຂມັນທັງໝົດໃນໂປຣຕີນ 0.7) ໃນໂປຣຕີນ 0.7 (ປະລິມານ Cer ໃນໄຂມັນທັງໝົດ)
ຄ່າທີ່ລາຍງານແມ່ນໄດ້ຮັບເປັນຄ່າສະເລ່ຍ, ແລະແຖບຄວາມຜິດພາດແມ່ນສຳເນົາສີ່ສະບັບເອກະລາດຂອງ SE. ຄວາມສຳຄັນທາງສະຖິຕິຂອງປັດໄຈ DE ແມ່ນຄິດໄລ່ໂດຍການທົດສອບ t [(averageDE-factor-1)/SE]. ຄິດໄລ່ຄ່າ P ຈາກການແຈກຢາຍຫາງດຽວ.
ເຄື່ອງມື GROMACS ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອຄິດໄລ່ແຜນທີ່ຄວາມໜາແໜ້ນດ້ານຂ້າງ 2D ຂອງລະບົບທີ່ມີ Emp24 ພາຍໃນ 250 ns ສຸດທ້າຍຂອງຮ່ອງຮອຍ. ເພື່ອໃຫ້ໄດ້ແຜນທີ່ການເສີມສ້າງ/ການຫຼຸດລົງຂອງ ceramide, ແຜນທີ່ຄວາມໜາແໜ້ນຂອງ Cer ແມ່ນຖືກຫານດ້ວຍຜົນບວກຂອງແຜນທີ່ຂອງ Cer ແລະ DOPC, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນຫານດ້ວຍຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ Cer ໃນຮ່າງກາຍ. ຂະໜາດແຜນທີ່ສີດຽວກັນຖືກນໍາໃຊ້.
ສຳລັບເອກະສານເສີມສຳລັບບົດຄວາມນີ້, ກະລຸນາເບິ່ງ http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
ນີ້ແມ່ນບົດຄວາມທີ່ສາມາດເຂົ້າເຖິງໄດ້ໂດຍບໍ່ເສຍຄ່າ ເຊິ່ງແຈກຢາຍພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂຂອງໃບອະນຸຍາດ Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, ເຊິ່ງອະນຸຍາດໃຫ້ນຳໃຊ້, ແຈກຢາຍ ແລະ ສຳເນົາໃນສື່ໃດກໍໄດ້, ຕາບໃດທີ່ການນຳໃຊ້ສຸດທ້າຍບໍ່ແມ່ນເພື່ອຜົນປະໂຫຍດທາງການຄ້າ ແລະ ຫຼັກຖານແມ່ນວ່າຜົນງານຕົ້ນສະບັບຖືກຕ້ອງ. ອ້າງອີງ.
ໝາຍເຫດ: ພວກເຮົາພຽງແຕ່ຂໍໃຫ້ທ່ານໃຫ້ທີ່ຢູ່ອີເມວຂອງທ່ານເພື່ອໃຫ້ບຸກຄົນທີ່ທ່ານແນະນຳໃຫ້ກັບໜ້າເວັບຮູ້ວ່າທ່ານຕ້ອງການໃຫ້ເຂົາເຈົ້າເຫັນອີເມວ ແລະ ມັນບໍ່ແມ່ນສະແປມ. ພວກເຮົາຈະບໍ່ບັນທຶກທີ່ຢູ່ອີເມວໃດໆ.
ຄຳຖາມນີ້ແມ່ນໃຊ້ເພື່ອທົດສອບວ່າທ່ານເປັນຜູ້ມາຢ້ຽມຊົມຫຼືບໍ່ ແລະ ປ້ອງກັນການສົ່ງສະແປມໂດຍອັດຕະໂນມັດ.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Lópezio Maria Perez (-- Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
ການຖ່າຍພາບແບບ 3D ທີ່ມີຄວາມລະອຽດສູງໃນເວລາຈິງເປີດເຜີຍໃຫ້ເຫັນເຖິງຄວາມສຳຄັນຂອງຄວາມຍາວຂອງລະບົບຕ່ອງໂສ້ ceramide ສຳລັບການຈັດຮຽງໂປຣຕີນໃນສະຖານທີ່ຜົນຜະລິດທີ່ເລືອກ.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Lópezio Maria Perez (-- Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
ການຖ່າຍພາບແບບ 3D ທີ່ມີຄວາມລະອຽດສູງໃນເວລາຈິງເປີດເຜີຍໃຫ້ເຫັນເຖິງຄວາມສຳຄັນຂອງຄວາມຍາວຂອງລະບົບຕ່ອງໂສ້ ceramide ສຳລັບການຈັດຮຽງໂປຣຕີນໃນສະຖານທີ່ຜົນຜະລິດທີ່ເລືອກ.
© 2020 ສະມາຄົມອາເມລິກາເພື່ອຄວາມກ້າວໜ້າຂອງວິທະຍາສາດ. ສະຫງວນລິຂະສິດທັງໝົດ. AAAS ເປັນຄູ່ຮ່ວມງານຂອງ HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ແລະ COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.