ບົດຄວາມນີ້ແມ່ນສ່ວນໜຶ່ງຂອງຫົວຂໍ້ການຄົ້ນຄວ້າ “ການປັບປຸງຄວາມຕ້ານທານຂອງພືດຕະກຸນຖົ່ວຕໍ່ກັບເຊື້ອພະຍາດ ແລະ ສັດຕູພືດ”, ເບິ່ງບົດຄວາມທັງໝົດ 5 ບົດຄວາມ
ຕົວແທນສາເຫດຂອງພະຍາດເຊື້ອລາພືດ Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary ໃຊ້ຍຸດທະສາດຫຼາຍຊັ້ນເພື່ອຕິດເຊື້ອພືດເຈົ້າພາບທີ່ແຕກຕ່າງກັນ. ການສຶກສານີ້ສະເໜີໃຫ້ໃຊ້ diamine L-ornithine, ເຊິ່ງເປັນກົດອະມິໂນທີ່ບໍ່ແມ່ນໂປຣຕີນທີ່ກະຕຸ້ນການສັງເຄາະກົດອະມິໂນທີ່ສຳຄັນອື່ນໆ, ເປັນຍຸດທະສາດການຈັດການທາງເລືອກເພື່ອເສີມຂະຫຍາຍການຕອບສະໜອງທາງໂມເລກຸນ, ສະລີລະວິທະຍາ ແລະ ຊີວະເຄມີຂອງ Phaseolus vulgaris L. ຕໍ່ກັບເຊື້ອລາຂາວທີ່ເກີດຈາກ Pseudomonas sclerotiorum. ການທົດລອງໃນຫຼອດທົດລອງສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ L-ornithine ຍັບຍັ້ງການເຕີບໂຕຂອງເຊື້ອລາຂອງ S. pyrenoidosa ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນລັກສະນະທີ່ຂຶ້ນກັບປະລິມານຢາ. ຍິ່ງໄປກວ່ານັ້ນ, ມັນສາມາດຫຼຸດຜ່ອນຄວາມຮຸນແຮງຂອງເຊື້ອລາຂາວພາຍໃຕ້ສະພາບເຮືອນແກ້ວໄດ້ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ. ນອກຈາກນັ້ນ, L-ornithine ກະຕຸ້ນການເຕີບໂຕຂອງພືດທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວ, ຊີ້ບອກວ່າຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ L-ornithine ທີ່ໄດ້ຮັບການທົດສອບບໍ່ເປັນພິດຕໍ່ພືດທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວ. ນອກຈາກນັ້ນ, L-ornithine ຍັງເສີມຂະຫຍາຍການສະແດງອອກຂອງສານຕ້ານອະນຸມູນອິດສະລະທີ່ບໍ່ແມ່ນເອນໄຊມ໌ (ຟີນໍລິກ ແລະ ຟລາໂວນອຍທີ່ລະລາຍທັງໝົດ) ແລະ ສານຕ້ານອະນຸມູນອິດສະລະທາງເອນໄຊມ໌ (ຄາຕາເລສ (CAT), ເປີຣອກຊີເດສ (POX), ແລະ ໂພລີຟີນໍ ອົກຊີເດສ (PPO)), ແລະ ເພີ່ມການສະແດງອອກຂອງເຊື້ອທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບສານຕ້ານອະນຸມູນອິດສະລະສາມຊະນິດ (PvCAT1, PvSOD, ແລະ PvGR). ນອກຈາກນັ້ນ, ການວິເຄາະໃນຊິລິໂຄໄດ້ເປີດເຜີຍວ່າມີໂປຣຕີນ oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) ທີ່ສົມມຸດຕິຖານຢູ່ໃນຈີໂນມ S. sclerotiorum, ເຊິ່ງຄ້າຍຄືກັນກັບໂປຣຕີນ oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH) ຂອງ Aspergillus fijiensis (AfOAH) ແລະ Penicillium sp. (PlOAH) ໃນແງ່ຂອງການວິເຄາະໜ້າທີ່, ໂດເມນທີ່ອະນຸລັກ, ແລະ topology. ສິ່ງທີ່ໜ້າສົນໃຈແມ່ນການເພີ່ມ L-ornithine ໃສ່ນ້ຳຕົ້ມມັນຕົ້ນ dextrose (PDB) ໄດ້ເຮັດໃຫ້ການສະແດງອອກຂອງເຊື້ອ SsOAH ໃນເຊື້ອ S. sclerotiorum ຫຼຸດລົງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ. ໃນລັກສະນະດຽວກັນ, ການໃຊ້ L-ornithine ຈາກພາຍນອກໄດ້ຫຼຸດຜ່ອນການສະແດງອອກຂອງ gene SsOAH ໃນເຊື້ອເຫັດທີ່ເກັບມາຈາກພືດທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ. ສຸດທ້າຍ, ການໃຊ້ L-ornithine ຫຼຸດຜ່ອນການຫຼั่งກົດ oxalic ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍທັງໃນອາຫານ PDB ແລະໃບທີ່ຕິດເຊື້ອ. ສະຫຼຸບແລ້ວ, L-ornithine ມີບົດບາດສຳຄັນໃນການຮັກສາສະຖານະພາບ redox ເຊັ່ນດຽວກັນກັບການເພີ່ມການຕອບສະໜອງການປ້ອງກັນຂອງພືດທີ່ຕິດເຊື້ອ. ຜົນຂອງການສຶກສານີ້ອາດຈະຊ່ວຍໃນການພັດທະນາວິທີການທີ່ມີນະວັດຕະກໍາແລະເປັນມິດກັບສິ່ງແວດລ້ອມເພື່ອຄວບຄຸມເຊື້ອລາຂາວ ແລະ ຫຼຸດຜ່ອນຜົນກະທົບຕໍ່ການຜະລິດຖົ່ວ ແລະ ພືດອື່ນໆ.
ເຊື້ອລາສີຂາວ, ເຊິ່ງເກີດຈາກເຊື້ອລາ Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, ເປັນພະຍາດທີ່ຮ້າຍແຮງ ແລະ ເຮັດໃຫ້ຜົນຜະລິດຫຼຸດລົງ ເຊິ່ງເປັນໄພຂົ່ມຂູ່ຮ້າຍແຮງຕໍ່ການຜະລິດຖົ່ວທົ່ວໂລກ (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum ແມ່ນໜຶ່ງໃນເຊື້ອລາທີ່ເກີດໃນດິນທີ່ຄວບຄຸມໄດ້ຍາກທີ່ສຸດ, ມີພືດທີ່ເປັນເຈົ້າພາບຫຼາຍກວ່າ 600 ຊະນິດ ແລະ ມີຄວາມສາມາດໃນການລະລາຍເນື້ອເຍື່ອຂອງເຈົ້າພາບໄດ້ໄວໃນລັກສະນະທີ່ບໍ່ຈຳເພາະເຈາະຈົງ (Liang ແລະ Rollins, 2018). ພາຍໃຕ້ສະພາບທີ່ບໍ່ເອື້ອອຳນວຍ, ມັນຈະຜ່ານໄລຍະທີ່ສຳຄັນຂອງວົງຈອນຊີວິດຂອງມັນ, ຍັງຄົງຢູ່เฉยๆ ເປັນເວລາດົນນານ ເປັນໂຄງສ້າງສີດຳ, ແຂງ, ຄ້າຍຄືເມັດທີ່ເອີ້ນວ່າ 'sclerotia' ໃນດິນ ຫຼື ເປັນການເຕີບໂຕສີຂາວ, ຟູຢູ່ໃນເຊື້ອລາ ຫຼື ເຍື່ອລຳຕົ້ນຂອງພືດທີ່ຕິດເຊື້ອ (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum ສາມາດສ້າງເປັນ sclerotia, ເຊິ່ງຊ່ວຍໃຫ້ມັນສາມາດຢູ່ລອດໄດ້ໃນທົ່ງນາທີ່ຕິດເຊື້ອເປັນເວລາດົນ ແລະ ຍັງຄົງຢູ່ໃນຊ່ວງທີ່ເປັນພະຍາດ (Schwartz et al., 2005). Sclerotia ອຸດົມໄປດ້ວຍສານອາຫານ, ສາມາດຢູ່ໃນດິນໄດ້ເປັນເວລາດົນ, ແລະ ເປັນແຫຼ່ງເຊື້ອພະຍາດຫຼັກສຳລັບການຕິດເຊື້ອຕໍ່ມາ (Schwartz et al., 2005). ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂທີ່ເອື້ອອຳນວຍ, sclerotia ຈະແຕກງອກ ແລະ ຜະລິດສະປໍທີ່ລອຍຢູ່ໃນອາກາດ ເຊິ່ງສາມາດຕິດເຊື້ອທຸກສ່ວນທີ່ຢູ່ເໜືອດິນຂອງພືດ, ລວມທັງແຕ່ບໍ່ຈຳກັດພຽງແຕ່ດອກ, ລຳຕົ້ນ, ຫຼື ຝັກ (Schwartz et al., 2005).
ເຊື້ອເຫັດ Sclerotinia sclerotiorum ໃຊ້ຍຸດທະສາດຫຼາຍຊັ້ນເພື່ອຕິດເຊື້ອພືດເຈົ້າພາບ, ເຊິ່ງກ່ຽວຂ້ອງກັບເຫດການທີ່ປະສານງານກັນຕັ້ງແຕ່ການແຕກງອກຂອງເຊື້ອເຫັດຈົນເຖິງການພັດທະນາອາການ. ໃນເບື້ອງຕົ້ນ, ເຊື້ອເຫັດ S. sclerotiorum ຜະລິດສະປໍທີ່ລອຍຢູ່ (ເອີ້ນວ່າ ascospores) ຈາກໂຄງສ້າງຄ້າຍຄືເຫັດທີ່ເອີ້ນວ່າ apothecia, ເຊິ່ງກາຍເປັນເຊື້ອເຫັດທີ່ລອຍຢູ່ໃນອາກາດ ແລະ ພັດທະນາໄປສູ່ເຊື້ອເຫັດທີ່ບໍ່ສາມາດເຄື່ອນທີ່ຢູ່ເທິງຊາກພືດທີ່ຕິດເຊື້ອ (Bolton et al., 2006). ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ເຊື້ອເຫັດຈະປ່ອຍກົດ oxalic, ເຊິ່ງເປັນປັດໄຈຄວາມຮຸນແຮງ, ເພື່ອຄວບຄຸມ pH ຂອງຝາເຊວພືດ, ສົ່ງເສີມການເສື່ອມໂຊມຂອງເອນໄຊມ໌ ແລະ ການບຸກລຸກຂອງເນື້ອເຍື່ອ (Hegedus ແລະ Rimmer, 2005), ແລະ ສະກັດກັ້ນການແຕກອອກຂອງອົກຊີເດຊັນຂອງພືດເຈົ້າພາບ. ຂະບວນການເຮັດໃຫ້ເປັນກົດນີ້ເຮັດໃຫ້ຝາເຊວພືດອ່ອນແອລົງ, ສະໜອງສະພາບແວດລ້ອມທີ່ເອື້ອອຳນວຍໃຫ້ແກ່ການເຮັດວຽກປົກກະຕິ ແລະ ມີປະສິດທິພາບຂອງເອນໄຊມ໌ທີ່ເສື່ອມໂຊມຂອງຝາເຊວເຊື້ອເຫັດ (CWDEs), ຊ່ວຍໃຫ້ເຊື້ອພະຍາດສາມາດເອົາຊະນະສິ່ງກີດຂວາງທາງກາຍະພາບ ແລະ ເຈາະເຂົ້າໄປໃນເນື້ອເຍື່ອເຈົ້າພາບ (Marciano et al., 1983). ເມື່ອເຈາະເຂົ້າໄປໃນເນື້ອເຍື່ອແລ້ວ, S. sclerotiorum ຈະປ່ອຍ CWDE ຈຳນວນໜຶ່ງອອກມາ, ເຊັ່ນ: polygalacturonase ແລະ cellulase, ເຊິ່ງຊ່ວຍໃຫ້ການແຜ່ກະຈາຍຂອງມັນໄປໃນເນື້ອເຍື່ອທີ່ຕິດເຊື້ອ ແລະ ເຮັດໃຫ້ເກີດການເນົ່າເປື່ອຍຂອງເນື້ອເຍື່ອ. ຄວາມຄືບໜ້າຂອງຮອຍແຜ ແລະ ຜ້າ hyphal ນຳໄປສູ່ອາການລັກສະນະຂອງເຊື້ອລາຂາວ (Hegedus ແລະ Rimmer, 2005). ໃນຂະນະດຽວກັນ, ພືດເຈົ້າພາບຮັບຮູ້ຮູບແບບໂມເລກຸນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບເຊື້ອພະຍາດ (PAMPs) ຜ່ານຕົວຮັບການຮັບຮູ້ຮູບແບບ (PRRs), ເຊິ່ງກະຕຸ້ນເຫດການສັນຍານຊຸດໜຶ່ງທີ່ສຸດທ້າຍກະຕຸ້ນການຕອບສະໜອງການປ້ອງກັນ.
ເຖິງວ່າຈະມີຄວາມພະຍາຍາມໃນການຄວບຄຸມພະຍາດມາເປັນເວລາຫຼາຍທົດສະວັດ, ແຕ່ການຂາດແຄນເຊື້ອພັນທີ່ຕ້ານທານໄດ້ພຽງພໍຍັງຄົງຢູ່ໃນຖົ່ວ, ເຊັ່ນດຽວກັບພືດການຄ້າອື່ນໆ, ເນື່ອງຈາກຄວາມຕ້ານທານ, ການຢູ່ລອດ, ແລະ ຄວາມສາມາດໃນການປັບຕົວຂອງເຊື້ອພະຍາດ. ດັ່ງນັ້ນ, ການຄຸ້ມຄອງພະຍາດຈຶ່ງເປັນສິ່ງທ້າທາຍຫຼາຍ ແລະ ຕ້ອງການຍຸດທະສາດທີ່ປະສົມປະສານ ແລະ ຫຼາຍດ້ານ ເຊິ່ງລວມມີການປະສົມປະສານຂອງການປະຕິບັດດ້ານວັດທະນະທຳ, ການຄວບຄຸມທາງຊີວະພາບ, ແລະ ຢາຂ້າເຊື້ອລາທາງເຄມີ (O'Sullivan et al., 2021). ການຄວບຄຸມເຊື້ອລາທາງເຄມີຂອງເຊື້ອລາຂາວແມ່ນມີປະສິດທິພາບທີ່ສຸດ ເພາະວ່າຢາຂ້າເຊື້ອລາ, ເມື່ອນຳໃຊ້ຢ່າງຖືກຕ້ອງ ແລະ ໃນເວລາທີ່ເໝາະສົມ, ສາມາດຄວບຄຸມການແຜ່ລະບາດຂອງພະຍາດໄດ້ຢ່າງມີປະສິດທິພາບ, ຫຼຸດຜ່ອນຄວາມຮຸນແຮງຂອງການຕິດເຊື້ອ, ແລະ ຫຼຸດຜ່ອນການສູນເສຍຜົນຜະລິດ. ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ການໃຊ້ຫຼາຍເກີນໄປ ແລະ ການເພິ່ງພາຢາຂ້າເຊື້ອລາຫຼາຍເກີນໄປສາມາດນຳໄປສູ່ການເກີດຂຶ້ນຂອງເຊື້ອພັນທີ່ຕ້ານທານຂອງ S. sclerotiorum ແລະ ສົ່ງຜົນກະທົບທາງລົບຕໍ່ສິ່ງມີຊີວິດທີ່ບໍ່ແມ່ນເປົ້າໝາຍ, ສຸຂະພາບຂອງດິນ, ແລະ ຄຸນນະພາບນ້ຳ (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). ດັ່ງນັ້ນ, ການຊອກຫາທາງເລືອກທີ່ເປັນມິດກັບສິ່ງແວດລ້ອມໄດ້ກາຍເປັນບູລິມະສິດອັນດັບຕົ້ນໆ.
ໂພລີອາມີນ (PAs), ເຊັ່ນ: putrescine, spermidine, spermine, ແລະ cadaverine, ສາມາດເປັນທາງເລືອກທີ່ມີຄວາມຫວັງຕໍ່ກັບເຊື້ອພະຍາດພືດທີ່ຕິດຢູ່ໃນດິນ, ດັ່ງນັ້ນຈຶ່ງຫຼຸດຜ່ອນການໃຊ້ຢາຂ້າເຊື້ອລາທາງເຄມີທີ່ເປັນອັນຕະລາຍໄດ້ທັງໝົດ ຫຼື ບາງສ່ວນ (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). ໃນພືດຊັ້ນສູງ, PAs ມີສ່ວນຮ່ວມໃນຂະບວນການທາງສະລີລະວິທະຍາຫຼາຍຢ່າງລວມທັງ, ແຕ່ບໍ່ຈຳກັດພຽງແຕ່, ການແບ່ງຈຸລັງ, ການຈຳແນກ, ແລະການຕອບສະໜອງຕໍ່ຄວາມກົດດັນທີ່ບໍ່ມີຊີວິດຊີວາ ແລະ ຊີວະພາບ (Killiny ແລະ Nehela, 2020). ພວກມັນສາມາດເຮັດໜ້າທີ່ເປັນສານຕ້ານອະນຸມູນອິດສະລະ, ຊ່ວຍກຳຈັດຊະນິດອົກຊີເຈນທີ່ມີປະຕິກິລິຍາ (ROS), ຮັກສາ homeostasis redox (Nehela ແລະ Killiny, 2023), ກະຕຸ້ນ gene ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບການປ້ອງກັນ (Romero et al., 2018), ຄວບຄຸມເສັ້ນທາງການເຜົາຜານອາຫານຕ່າງໆ (Nehela ແລະ Killiny, 2023), ປັບປຸງ phytohormones ພາຍໃນ (Nehela ແລະ Killiny, 2019), ສ້າງຄວາມຕ້ານທານທີ່ໄດ້ມາຢ່າງເປັນລະບົບ (SAR), ແລະຄວບຄຸມການພົວພັນລະຫວ່າງພືດກັບເຊື້ອພະຍາດ (Nehela ແລະ Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). ມັນເປັນສິ່ງທີ່ໜ້າສັງເກດວ່າກົນໄກ ແລະ ບົດບາດສະເພາະຂອງ PAs ໃນການປ້ອງກັນພືດແຕກຕ່າງກັນໄປຕາມຊະນິດພືດ, ເຊື້ອພະຍາດ, ແລະ ສະພາບແວດລ້ອມ. PA ທີ່ມີຢູ່ຫຼາຍທີ່ສຸດໃນພືດແມ່ນສັງເຄາະທາງຊີວະພາບຈາກ polyamine L-ornithine ທີ່ຈຳເປັນ (Killiny ແລະ Nehela, 2020).
L-ornithine ມີບົດບາດຫຼາຍຢ່າງໃນການເຕີບໃຫຍ່ ແລະ ການພັດທະນາຂອງພືດ. ຕົວຢ່າງ, ການສຶກສາທີ່ຜ່ານມາໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າໃນເຂົ້າ (Oryza sativa), ornithine ອາດຈະກ່ຽວຂ້ອງກັບການຣີໄຊເຄີນໄນໂຕຣເຈນ (Liu et al., 2018), ຜົນຜະລິດເຂົ້າ, ຄຸນນະພາບ ແລະ ກິ່ນຫອມ (Lu et al., 2020), ແລະ ການຕອບສະໜອງຕໍ່ຄວາມກົດດັນຂອງນ້ຳ (Yang et al., 2000). ນອກຈາກນັ້ນ, ການໃຊ້ L-ornithine ຈາກພາຍນອກໄດ້ເສີມຂະຫຍາຍຄວາມທົນທານຕໍ່ໄພແຫ້ງແລ້ງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນຕົ້ນ beet ນ້ຳຕານ (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) ແລະ ຫຼຸດຜ່ອນຄວາມກົດດັນຂອງເກືອໃນຕົ້ນຜັກບົ່ວ (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu ແລະ Çavuşoǧlu, 2021) ແລະ ຕົ້ນໝາກມ່ວງຫິມະພານ (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). ບົດບາດທີ່ມີທ່າແຮງຂອງ L-ornithine ໃນການປ້ອງກັນຄວາມກົດດັນທີ່ບໍ່ມີຊີວິດຊີວາອາດຈະເປັນຍ້ອນການມີສ່ວນຮ່ວມໃນການສະສົມ proline ໃນພືດທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວ. ຕົວຢ່າງ, ພັນທຸກໍາທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບການເຜົາຜານໂປຣລີນ, ເຊັ່ນ: ພັນທຸກໍາ ornithine delta aminotransferase (delta-OAT) ແລະ ພັນທຸກໍາ proline dehydrogenase (ProDH1 ແລະ ProDH2), ໄດ້ຖືກລາຍງານວ່າມີສ່ວນຮ່ວມໃນການປ້ອງກັນ Nicotiana benthamiana ແລະ Arabidopsis thaliana ຕໍ່ກັບເຊື້ອ Pseudomonas syringae ທີ່ບໍ່ແມ່ນເຈົ້າພາບ (Senthil-Kumar ແລະ Mysore, 2012). ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, ເຊື້ອເຫັດ ornithine decarboxylase (ODC) ແມ່ນຈໍາເປັນສໍາລັບການເຕີບໂຕຂອງເຊື້ອພະຍາດ (Singh et al., 2020). ການເປົ້າໝາຍ ODC ຂອງ Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici ຜ່ານການສະກັດກັ້ນພັນທຸກໍາທີ່ກະຕຸ້ນໂດຍເຈົ້າພາບ (HIGS) ໄດ້ເສີມຂະຫຍາຍຄວາມຕ້ານທານຂອງຕົ້ນຫມາກເລັ່ນຕໍ່ກັບການຫ່ຽວແຫ້ງຂອງ Fusarium (Singh et al., 2020). ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ບົດບາດທີ່ມີທ່າແຮງຂອງການໃຊ້ ornithine ຈາກພາຍນອກຕໍ່ກັບຄວາມກົດດັນທາງຊີວະພາບເຊັ່ນ: ເຊື້ອພະຍາດພືດຍັງບໍ່ທັນໄດ້ຮັບການສຶກສາຢ່າງດີ. ສິ່ງທີ່ສຳຄັນກວ່ານັ້ນ, ຜົນກະທົບຂອງ ornithine ຕໍ່ການຕ້ານທານພະຍາດ ແລະ ປະກົດການທາງຊີວະເຄມີ ແລະ ສະລີລະວິທະຍາທີ່ກ່ຽວຂ້ອງຍັງບໍ່ທັນໄດ້ຮັບການສຳຫຼວດເທື່ອ.
ການເຂົ້າໃຈຄວາມຊັບຊ້ອນຂອງການຕິດເຊື້ອ S. sclerotiorum ໃນພືດຕະກຸນຖົ່ວແມ່ນມີຄວາມສຳຄັນຕໍ່ການພັດທະນາຍຸດທະສາດການຄວບຄຸມທີ່ມີປະສິດທິພາບ. ໃນການສຶກສາຄັ້ງນີ້, ພວກເຮົາມີຈຸດປະສົງເພື່ອກຳນົດບົດບາດທີ່ມີທ່າແຮງຂອງ diamine L-ornithine ເປັນປັດໄຈສຳຄັນໃນການເສີມຂະຫຍາຍກົນໄກການປ້ອງກັນ ແລະ ຄວາມຕ້ານທານຂອງພືດຕະກຸນຖົ່ວຕໍ່ກັບການຕິດເຊື້ອ Sclerotinia sclerotiorum. ພວກເຮົາສົມມຸດຕິຖານວ່າ, ນອກເໜືອໄປຈາກການເພີ່ມການຕອບສະໜອງການປ້ອງກັນຂອງພືດທີ່ຕິດເຊື້ອ, L-ornithine ຍັງມີບົດບາດສຳຄັນໃນການຮັກສາສະຖານະພາບ redox. ພວກເຮົາສະເໜີວ່າຜົນກະທົບທີ່ອາດເກີດຂຶ້ນຂອງ L-ornithine ແມ່ນກ່ຽວຂ້ອງກັບການຄວບຄຸມກົນໄກການປ້ອງກັນສານຕ້ານອະນຸມູນອິດສະລະທີ່ມີເອນໄຊມ໌ ແລະ ບໍ່ແມ່ນເອນໄຊມ໌ ແລະ ການແຊກແຊງກັບປັດໄຈການເກີດພະຍາດ/ຄວາມຮຸນແຮງຂອງເຊື້ອລາ ແລະ ໂປຣຕີນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງ. ໜ້າທີ່ສອງຢ່າງນີ້ຂອງ L-ornithine ເຮັດໃຫ້ມັນເປັນຜູ້ສະໝັກທີ່ມີຄວາມຫວັງສຳລັບຍຸດທະສາດທີ່ຍືນຍົງເພື່ອຫຼຸດຜ່ອນຜົນກະທົບຂອງເຊື້ອລາຂາວ ແລະ ເສີມຂະຫຍາຍຄວາມຕ້ານທານຂອງພືດຕະກຸນຖົ່ວທົ່ວໄປຕໍ່ກັບເຊື້ອລາທີ່ມີທ່າແຮງນີ້. ຜົນຂອງການສຶກສາໃນປະຈຸບັນອາດຈະຊ່ວຍໃນການພັດທະນາວິທີການທີ່ມີນະວັດຕະກຳ ແລະ ເປັນມິດກັບສິ່ງແວດລ້ອມເພື່ອຄວບຄຸມເຊື້ອລາຂາວ ແລະ ຫຼຸດຜ່ອນຜົນກະທົບຕໍ່ການຜະລິດພືດຕະກຸນຖົ່ວ.
ໃນການສຶກສາຄັ້ງນີ້, ຖົ່ວພັນທຳມະດາທີ່ມີຄວາມອ່ອນໄຫວຕໍ່ການຄ້າ, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), ໄດ້ຖືກນຳໃຊ້ເປັນວັດສະດຸທົດລອງ. ແກ່ນພືດທີ່ມີສຸຂະພາບດີໄດ້ຮັບການສະໜອງໃຫ້ໂດຍພະແນກຄົ້ນຄວ້າພືດຕະກຸນຖົ່ວ, ສະຖາບັນຄົ້ນຄວ້າພືດກະສິກຳ (FCRI), ສູນຄົ້ນຄວ້າກະສິກຳ (ARC), ປະເທດເອຢິບ. ແກ່ນພືດຫ້າເມັດໄດ້ຖືກຫວ່ານລົງໃນກະຖາງພາດສະຕິກ (ເສັ້ນຜ່າສູນກາງພາຍໃນ 35 ຊມ, ຄວາມເລິກ 50 ຊມ) ທີ່ເຕັມໄປດ້ວຍດິນທີ່ຕິດເຊື້ອ S. sclerotiorum ພາຍໃຕ້ສະພາບເຮືອນແກ້ວ (25 ± 2 °C, ຄວາມຊຸ່ມຊື່ນສຳພັດ 75 ± 1%, ແສງສະຫວ່າງ 8 ຊົ່ວໂມງ/ມືດ 16 ຊົ່ວໂມງ). ຫຼັງຈາກຫວ່ານແລ້ວ 7-10 ມື້ (DPS), ເບ້ຍໄມ້ໄດ້ຖືກຕັດບາງລົງເພື່ອໃຫ້ເຫຼືອພຽງສອງເບ້ຍໄມ້ທີ່ມີການເຕີບໃຫຍ່ສະໝໍ່າສະເໝີ ແລະ ມີໃບຂະຫຍາຍເຕັມທີ່ສາມໃບໃນແຕ່ລະກະຖາງ. ຕົ້ນໄມ້ທີ່ປູກໃນກະຖາງທັງໝົດໄດ້ຖືກຫົດນ້ຳທຸກໆສອງອາທິດ ແລະ ໃສ່ປຸ໋ຍທຸກໆເດືອນໃນອັດຕາທີ່ແນະນຳສຳລັບແນວພັນທີ່ກຳນົດໃຫ້.
ເພື່ອກະກຽມຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ 500 ມກ/ລິດ ຂອງ L-ornithinediamine (ເຊິ່ງເອີ້ນກັນວ່າ (+)-(S)-2,5-diaminopentanoic acid; Sigma-Aldrich, Darmstadt, ເຢຍລະມັນ), 50 ມກ ໄດ້ຖືກລະລາຍໃນນ້ຳກັ່ນທີ່ປອດເຊື້ອ 100 ມລ. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ສານລະລາຍສະຕັອກໄດ້ຖືກລະລາຍ ແລະ ນຳໃຊ້ໃນການທົດລອງຕໍ່ໆໄປ. ໂດຍຫຍໍ້, ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ L-ornithine ຫົກຊຸດ (12.5, 25, 50, 75, 100, ແລະ 125 ມກ/ລິດ) ໄດ້ຖືກທົດສອບໃນຫຼອດທົດລອງ. ນອກຈາກນັ້ນ, ນ້ຳກັ່ນທີ່ປອດເຊື້ອໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເປັນຕົວຄວບຄຸມທາງລົບ (Mock) ແລະ ຢາຂ້າເຊື້ອລາທາງການຄ້າ “Rizolex-T” ຜົງປຽກ 50% (toclofos-methyl 20% + thiram 30%; ບໍລິສັດຢາຂ້າແມງໄມ້ ແລະ ເຄມີ KZ-Kafr El Zayat, Kafr El Zayat, Gharbia Governorate, ອີຢິບ) ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເປັນຕົວຄວບຄຸມທາງບວກ. ຢາຂ້າເຊື້ອລາທາງການຄ້າ “Rizolex-T” ໄດ້ຖືກທົດສອບໃນຫຼອດທົດລອງທີ່ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຫ້າລະດັບ (2, 4, 6, 8 ແລະ 10 ມກ/ລິດ).
ຕົວຢ່າງຂອງລຳຕົ້ນ ແລະ ຝັກຖົ່ວທົ່ວໄປທີ່ສະແດງອາການທົ່ວໄປຂອງເຊື້ອລາສີຂາວ (ອັດຕາການລະບາດ: 10–30%) ໄດ້ຖືກເກັບມາຈາກຟາມການຄ້າ. ເຖິງແມ່ນວ່າວັດສະດຸພືດທີ່ຕິດເຊື້ອສ່ວນໃຫຍ່ໄດ້ຖືກລະບຸໂດຍຊະນິດ/ພັນ (ແນວພັນການຄ້າທີ່ອ່ອນໄຫວ Giza 3), ສ່ວນອື່ນໆ, ໂດຍສະເພາະແມ່ນແນວພັນທີ່ໄດ້ມາຈາກຕະຫຼາດທ້ອງຖິ່ນ, ແມ່ນຊະນິດທີ່ບໍ່ຮູ້ຈັກ. ວັດສະດຸທີ່ຕິດເຊື້ອທີ່ເກັບມາໄດ້ຖືກຂ້າເຊື້ອພື້ນຜິວດ້ວຍສານລະລາຍໂຊດຽມໄຮໂປຄລໍໄຣ 0.5% ເປັນເວລາ 3 ນາທີ, ຈາກນັ້ນລ້າງຫຼາຍຄັ້ງດ້ວຍນ້ຳກັ່ນທີ່ປອດເຊື້ອ ແລະ ເຊັດໃຫ້ແຫ້ງດ້ວຍເຈ້ຍກອງທີ່ປອດເຊື້ອເພື່ອເອົານ້ຳເກີນອອກ. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ອະໄວຍະວະທີ່ຕິດເຊື້ອໄດ້ຖືກຕັດເປັນຕ່ອນນ້ອຍໆຈາກເນື້ອເຍື່ອກາງ (ລະຫວ່າງເນື້ອເຍື່ອທີ່ມີສຸຂະພາບດີ ແລະ ເນື້ອເຍື່ອທີ່ຕິດເຊື້ອ), เพาะเลี้ยงໃນອາຫານວ່າງມັນຕົ້ນເດກໂຕຣສອາກາ (PDA) ແລະ ບົ່ມທີ່ອຸນຫະພູມ 25 ± 2 °C ດ້ວຍວົງຈອນແສງສະຫວ່າງ 12 ຊົ່ວໂມງ/ມືດ 12 ຊົ່ວໂມງເປັນເວລາ 5 ມື້ເພື່ອກະຕຸ້ນການສ້າງເຊລໂຄເຕຍ. ວິທີການປາຍມ່ານຍັງຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອເຮັດໃຫ້ເຊື້ອລາທີ່ແຍກອອກຈາກວັດທະນະທໍາປະສົມ ຫຼື ປົນເປື້ອນ. ເຊື້ອລາທີ່ແຍກອອກມາໄດ້ຖືກລະບຸໃນເບື້ອງຕົ້ນໂດຍອີງໃສ່ລັກສະນະທາງສະລີລະວິທະຍາຂອງມັນ ແລະ ຫຼັງຈາກນັ້ນຢືນຢັນວ່າເປັນ S. sclerotiorum ໂດຍອີງໃສ່ລັກສະນະກ້ອງຈຸລະທັດ. ສຸດທ້າຍ, ເຊື້ອແບັກທີເຣັຍທີ່ບໍລິສຸດທັງໝົດໄດ້ຖືກທົດສອບການເປັນພະຍາດໃນຖົ່ວພັນທົ່ວໄປທີ່ອ່ອນໄຫວ Giza 3 ເພື່ອຕອບສະໜອງສົມມຸດຕິຖານຂອງ Koch.
ນອກຈາກນັ້ນ, ເຊື້ອແບັກທີເຣຍ S. sclerotiorum ທີ່ຮຸກຮານທີ່ສຸດ (ເຊື້ອແບັກທີເຣຍ #3) ໄດ້ຮັບການຢືນຢັນຕື່ມອີກໂດຍອີງໃສ່ການຈັດລຳດັບຂອງຕົວແຍກພາຍໃນ (ITS) ຕາມທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໂດຍ White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. ໂດຍຫຍໍ້, ເຊື້ອແບັກທີເຣຍໄດ້ຖືກเพาะเลี้ยงໃນນ້ຳຕົ້ມມັນຕົ້ນເດັກສ໌ໂຕຣສ (PDB) ແລະ ບົ່ມຢູ່ທີ່ອຸນຫະພູມ 25 ± 2 °C ເປັນເວລາ 5–7 ມື້. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ເຊື້ອເຫັດຈາກເຊື້ອລາໄດ້ຖືກເກັບກຳ, ກັ່ນຕອງຜ່ານຜ້າເຊັດໂຕ, ລ້າງສອງຄັ້ງດ້ວຍນ້ຳທີ່ໝັນ, ແລະ ຕາກໃຫ້ແຫ້ງດ້ວຍເຈ້ຍກອງທີ່ໝັນ. DNA ຈີໂນມໄດ້ຖືກແຍກໂດຍໃຊ້ຊຸດ Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ພາກພື້ນ rDNA ຂອງ ITS ໄດ້ຖືກຂະຫຍາຍໂດຍໃຊ້ຄູ່ primer ສະເພາະ ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; ຂະໜາດທີ່ຄາດໄວ້: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). ຜະລິດຕະພັນ PCR ທີ່ບໍລິສຸດໄດ້ຖືກສົ່ງໄປເພື່ອການຈັດລຳດັບ (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). ລຳດັບ rDNA ຂອງ ITS ໄດ້ຖືກຈັດລຳດັບສອງທິດທາງໂດຍໃຊ້ວິທີການຈັດລຳດັບ Sanger. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ລຳດັບການສອບຖາມທີ່ປະກອບເຂົ້າກັນໄດ້ຖືກປຽບທຽບກັບຂໍ້ມູນລ່າສຸດໃນ GenBank ແລະສູນຂໍ້ມູນຂ່າວສານເຕັກໂນໂລຊີຊີວະພາບແຫ່ງຊາດ (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) ໂດຍໃຊ້ຊອບແວ BLASTn. ລຳດັບການສອບຖາມໄດ້ຖືກປຽບທຽບກັບເຊື້ອພັນ/ເຊື້ອພັນ S. sclerotiorum ອື່ນໆອີກ 20 ຊະນິດທີ່ດຶງມາຈາກຂໍ້ມູນລ່າສຸດໃນ NCBI GenBank (ຕາຕະລາງເສີມ S1) ໂດຍໃຊ້ ClustalW ໃນຊຸດການວິເຄາະພັນທຸກໍາວິວັດທະນາການໂມເລກຸນ (MEGA-11; ເວີຊັນ 11) (Kumar et al., 2024). ການວິເຄາະວິວັດທະນາການໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ວິທີການຄວາມເປັນໄປໄດ້ສູງສຸດ ແລະ ຮູບແບບການທົດແທນນິວຄລີໂອໄທດ໌ທີ່ສາມາດປີ້ນກັບກັນໄດ້ຕາມເວລາທົ່ວໄປ (Nei ແລະ Kumar, 2000). ຕົ້ນໄມ້ທີ່ມີຄວາມເປັນໄປໄດ້ຂອງ log ສູງສຸດແມ່ນສະແດງໃຫ້ເຫັນ. ຕົ້ນໄມ້ເບື້ອງຕົ້ນສຳລັບການຄົ້ນຫາແບບ heuristic ແມ່ນເລືອກໂດຍການເລືອກຕົ້ນໄມ້ທີ່ມີຄວາມເປັນໄປໄດ້ຂອງ log ສູງກວ່າລະຫວ່າງຕົ້ນໄມ້ neighbor-joining (NJ) (Kumar et al., 2024) ແລະຕົ້ນໄມ້ parsimony ສູງສຸດ (MP). ຕົ້ນໄມ້ NJ ໄດ້ຖືກສ້າງຂຶ້ນໂດຍໃຊ້ແມັດຕຣິກໄລຍະທາງຄູ່ທີ່ຄິດໄລ່ໂດຍໃຊ້ຮູບແບບການປ່ຽນແປງເວລາທົ່ວໄປ (Nei ແລະ Kumar, 2000).
ກິດຈະກຳຕ້ານເຊື້ອແບັກທີເຣຍຂອງ L-ornithine ແລະ ຢາຂ້າເຊື້ອແບັກທີເຣຍ “Rizolex-T” ໄດ້ຖືກກຳນົດໃນຫຼອດທົດລອງໂດຍວິທີການແຜ່ກະຈາຍຂອງວຸ້ນ. ວິທີການ: ໃຊ້ປະລິມານທີ່ເໝາະສົມຂອງສານລະລາຍສະຕັອກຂອງ L-ornithine (500 ມກ/ລິດ) ແລະ ປະສົມໃຫ້ເຂົ້າກັນກັບສານອາຫານ PDA 10 ມລ ເພື່ອກະກຽມສານລະລາຍທີ່ມີຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນສຸດທ້າຍ 12.5, 25, 50, 75, 100 ແລະ 125 ມກ/ລິດ ຕາມລຳດັບ. ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຫ້າຢ່າງຂອງຢາຂ້າເຊື້ອລາ “Rizolex-T” (2, 4, 6, 8 ແລະ 10 ມກ/ລິດ) ແລະ ນ້ຳກັ່ນທີ່ປອດເຊື້ອໄດ້ຖືກນຳໃຊ້ເປັນຕົວຄວບຄຸມ. ຫຼັງຈາກສານໄດ້ແຂງຕົວແລ້ວ, ກ້ອນເຊື້ອເຫັດ Sclerotinia sclerotiorum ທີ່ກຽມໄວ້ໃໝ່ໆ, ເສັ້ນຜ່າສູນກາງ 4 ມມ, ໄດ້ຖືກຍ້າຍໄປຫາໃຈກາງຂອງຈານ Petri ແລະ เพาะเลี้ยงທີ່ອຸນຫະພູມ 25±2°C ຈົນກວ່າເຊື້ອເຫັດຈະປົກຄຸມຈານ Petri ຄວບຄຸມທັງໝົດ, ຫຼັງຈາກນັ້ນຈຶ່ງບັນທຶກການເຕີບໂຕຂອງເຊື້ອເຫັດ. ຄິດໄລ່ອັດຕາສ່ວນການຍັບຍັ້ງການຈະເລີນເຕີບໂຕຂອງຮາກຂອງ S. sclerotiorum ໂດຍໃຊ້ສົມຜົນທີ 1:
ການທົດລອງໄດ້ຖືກເຮັດຊ້ຳສອງຄັ້ງ, ໂດຍມີຫົກຕົວຢ່າງທາງຊີວະພາບສຳລັບແຕ່ລະກຸ່ມຄວບຄຸມ/ທົດລອງ ແລະ ຫ້າກະຖາງ (ສອງຕົ້ນຕໍ່ກະຖາງ) ສຳລັບແຕ່ລະຕົວຢ່າງທາງຊີວະພາບ. ແຕ່ລະຕົວຢ່າງທາງຊີວະພາບໄດ້ຖືກວິເຄາະສອງຄັ້ງ (ສອງຕົວຢ່າງທາງວິຊາການ) ເພື່ອຮັບປະກັນຄວາມຖືກຕ້ອງ, ຄວາມໜ້າເຊື່ອຖື ແລະ ຄວາມສາມາດໃນການຜະລິດຊ້ຳໄດ້ຂອງຜົນການທົດລອງ. ນອກຈາກນັ້ນ, ການວິເຄາະການຖົດຖອຍຂອງໂປຣບິດໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອຄິດໄລ່ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງການຍັບຍັ້ງເຄິ່ງສູງສຸດ (IC50) ແລະ IC99 (Prentice, 1976).
ເພື່ອປະເມີນທ່າແຮງຂອງ L-ornithine ພາຍໃຕ້ສະພາບເຮືອນແກ້ວ, ການທົດລອງສອງຄັ້ງຕິດຕໍ່ກັນໄດ້ຖືກດຳເນີນໃນໝໍ້. ໂດຍຫຍໍ້, ໝໍ້ໄດ້ຖືກເຕີມດ້ວຍດິນຊາຍໜຽວທີ່ຂ້າເຊື້ອແລ້ວ (3:1) ແລະ ປູກເຊື້ອດ້ວຍເຊື້ອ S. sclerotiorum ທີ່ກຽມໄວ້ໃໝ່ໆ. ກ່ອນອື່ນໝົດ, ເຊື້ອ S. sclerotiorum ທີ່ຮຸກຮານທີ່ສຸດ (ເຊື້ອ #3) ໄດ້ຖືກປູກໂດຍການຕັດ sclerotium ໜຶ່ງອອກເປັນສອງສ່ວນ, ວາງມັນໄວ້ໜ້າລົງເທິງ PDA ແລະ ບົ່ມຢູ່ທີ່ 25°C ໃນຄວາມມືດຄົງທີ່ (24 ຊົ່ວໂມງ) ເປັນເວລາ 4 ມື້ເພື່ອກະຕຸ້ນການເຕີບໂຕຂອງເຊື້ອລາ. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ສຽບ agar ຂະໜາດເສັ້ນຜ່າສູນກາງ 5 ມມ ຈຳນວນສີ່ອັນໄດ້ຖືກເອົາມາຈາກຂອບນຳໜ້າ ແລະ ປູກດ້ວຍສ່ວນປະສົມທີ່ຂ້າເຊື້ອຂອງເຂົ້າສາລີ ແລະ ຮຳເຂົ້າ 100 g (1:1, v/v) ແລະ ຂວດທັງໝົດໄດ້ຖືກບົ່ມຢູ່ທີ່ 25 ± 2 °C ພາຍໃຕ້ວົງຈອນແສງສະຫວ່າງ 12 ຊົ່ວໂມງ/ມືດ 12 ຊົ່ວໂມງ ເປັນເວລາ 5 ມື້ເພື່ອກະຕຸ້ນການສ້າງ sclerotia. ເນື້ອໃນຂອງຂວດທັງໝົດໄດ້ຖືກປະສົມຢ່າງລະອຽດເພື່ອຮັບປະກັນຄວາມເປັນເອກະພາບກ່ອນທີ່ຈະຕື່ມດິນ. ຈາກນັ້ນ, ຮຳທີ່ປະສົມເປັນອານານິຄົມ 100 ກຣາມ ໄດ້ຖືກຕື່ມໃສ່ໃນແຕ່ລະໝໍ້ເພື່ອຮັບປະກັນຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງເຊື້ອພະຍາດຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງ. ໝໍ້ທີ່ສັກເຊື້ອແລ້ວໄດ້ຖືກຫົດນ້ຳເພື່ອກະຕຸ້ນການເຕີບໂຕຂອງເຊື້ອລາ ແລະ ວາງໄວ້ໃນສະພາບເຮືອນແກ້ວເປັນເວລາ 7 ມື້.
ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ໄດ້ຫວ່ານເມັດພັນ Giza 3 ຈຳນວນຫ້າເມັດລົງໃນແຕ່ລະກະຖາງ. ສຳລັບກະຖາງທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ L-ornithine ແລະ ຢາຂ້າເຊື້ອລາ Rizolex-T, ເມັດທີ່ຂ້າເຊື້ອແລ້ວຈະຖືກແຊ່ນ້ຳເປັນເວລາສອງຊົ່ວໂມງໃນນ້ຳຢາປະສົມສອງຊະນິດທີ່ມີຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ IC99 ສຸດທ້າຍປະມານ 250 ມກ/ລິດ ແລະ 50 ມກ/ລິດ ຕາມລຳດັບ, ແລະ ຈາກນັ້ນກໍ່ຕາກແຫ້ງເປັນເວລາໜຶ່ງຊົ່ວໂມງກ່ອນຫວ່ານ. ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, ເມັດໄດ້ຖືກແຊ່ນ້ຳກັ່ນທີ່ຂ້າເຊື້ອເປັນຕົວຄວບຄຸມທາງລົບ. ຫຼັງຈາກ 10 ມື້, ກ່ອນການຫົດນ້ຳຄັ້ງທຳອິດ, ເບ້ຍໄມ້ໄດ້ຖືກແຍກອອກ, ໂດຍປະໄວ້ພຽງສອງເບ້ຍໄມ້ທີ່ສະອາດຢູ່ໃນແຕ່ລະກະຖາງ. ນອກຈາກນັ້ນ, ເພື່ອຮັບປະກັນການຕິດເຊື້ອດ້ວຍ S. sclerotiorum, ລຳຕົ້ນຖົ່ວໃນໄລຍະການພັດທະນາດຽວກັນ (10 ມື້) ໄດ້ຖືກຕັດຢູ່ສອງຈຸດທີ່ແຕກຕ່າງກັນໂດຍໃຊ້ມີດຜ່າຕັດທີ່ຂ້າເຊື້ອແລ້ວ ແລະ ປະມານ 0.5 ກຣາມຂອງສ່ວນປະສົມຮຳທີ່ເຕີບໃຫຍ່ໄດ້ຖືກວາງລົງໃນແຕ່ລະບາດແຜ, ຕາມດ້ວຍຄວາມຊຸ່ມຊື່ນສູງເພື່ອກະຕຸ້ນການຕິດເຊື້ອ ແລະ ການພັດທະນາຂອງພະຍາດໃນພືດທີ່ຖືກສັກຢາທັງໝົດ. ພືດຄວບຄຸມໄດ້ຮັບບາດເຈັບຄ້າຍຄືກັນ ແລະ ໄດ້ເອົາສ່ວນປະສົມຂອງຮຳທີ່ປອດເຊື້ອແລ້ວໃນປະລິມານເທົ່າກັນ (0.5 ກຣາມ) ໃສ່ໃນບາດແຜ ແລະ ຮັກສາໄວ້ພາຍໃຕ້ຄວາມຊຸ່ມຊື່ນສູງ ເພື່ອຈຳລອງສະພາບແວດລ້ອມສຳລັບການພັດທະນາຂອງພະຍາດ ແລະ ຮັບປະກັນຄວາມສອດຄ່ອງລະຫວ່າງກຸ່ມທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວ.
ວິທີການປິ່ນປົວ: ຕົ້ນຖົ່ວໄດ້ຖືກຫົດນ້ຳດ້ວຍສານລະລາຍນ້ຳ L-ornithine (250 ມກ/ລິດ) 500 ມລ ຫຼື ຢາຂ້າເຊື້ອລາ Rizolex-T (50 ມກ/ລິດ) ໂດຍການຫົດນ້ຳໃສ່ດິນ, ຫຼັງຈາກນັ້ນການປິ່ນປົວໄດ້ຖືກເຮັດຊ້ຳອີກສາມຄັ້ງດ້ວຍໄລຍະຫ່າງ 10 ມື້. ກຸ່ມຄວບຄຸມທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍຢາຫຼອກແມ່ນໄດ້ຫົດນ້ຳດ້ວຍນ້ຳກັ່ນທີ່ປອດເຊື້ອ 500 ມລ. ການປິ່ນປົວທັງໝົດໄດ້ຖືກປະຕິບັດພາຍໃຕ້ສະພາບເຮືອນແກ້ວ (25 ± 2°C, ຄວາມຊຸ່ມຊື່ນສຳພັດ 75 ± 1%, ແລະໄລຍະເວລາແສງ 8 ຊົ່ວໂມງ/ມືດ 16 ຊົ່ວໂມງ). ກະຖາງທັງໝົດໄດ້ຖືກຫົດນ້ຳທຸກໆສອງອາທິດ ແລະ ການປະຕິບັດທຸກໆເດືອນດ້ວຍປຸ໋ຍ NPK ທີ່ສົມດຸນ (20-20-20, ມີຊູນຟູຣິກ 3.6% ແລະ TE microelements; Zain Seeds, ອີຢິບ) ໃນຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ 3–4 ກຣາມ/ລິດ ໂດຍການສີດພົ່ນທາງໃບຕາມຄຳແນະນຳສຳລັບແນວພັນສະເພາະ ແລະ ຄຳແນະນຳຂອງຜູ້ຜະລິດ. ເວັ້ນເສຍແຕ່ຈະມີການລະບຸໄວ້ເປັນຢ່າງອື່ນ, ໃບທີ່ເຕີບໃຫຍ່ເຕັມທີ່ (ໃບທີ 2 ແລະ 3 ຈາກດ້ານເທິງ) ໄດ້ຖືກເກັບມາຈາກແຕ່ລະສຳເນົາທາງຊີວະວິທະຍາໃນເວລາ 72 ຊົ່ວໂມງຫຼັງການປິ່ນປົວ (hpt), ເຮັດໃຫ້ເປັນເອກະພາບ, ລວມເຂົ້າກັນ ແລະ ເກັບຮັກສາໄວ້ທີ່ -80 °C ສຳລັບການວິເຄາະຕື່ມອີກ ລວມທັງ, ແຕ່ບໍ່ຈຳກັດພຽງແຕ່, ການກຳນົດຕຳແໜ່ງທາງຮິສໂຕເຄມີໃນສະຖານທີ່ຂອງຕົວຊີ້ວັດຄວາມຄຽດອົກຊີເດຊັນ, ການຜຸພັງຂອງໄຂມັນ, ສານຕ້ານອະນຸມູນອິດສະລະທີ່ມີທັງທາງເອນໄຊ ແລະ ບໍ່ແມ່ນທາງເອນໄຊ ແລະ ການສະແດງອອກຂອງເຊື້ອ.
ຄວາມເຂັ້ມຂອງການຕິດເຊື້ອລາຂາວໄດ້ຖືກປະເມີນທຸກໆອາທິດ 21 ມື້ຫຼັງຈາກການສັກຢາ (dpi) ໂດຍໃຊ້ມາດຕະຖານ 1–9 (ຕາຕະລາງເສີມ S2) ໂດຍອີງໃສ່ມາດຕະຖານ Petzoldt ແລະ Dickson (1996) ທີ່ດັດແປງໂດຍ Teran et al. (2006). ໂດຍຫຍໍ້, ລຳຕົ້ນ ແລະ ກິ່ງງ່າຂອງຕົ້ນຖົ່ວໄດ້ຖືກກວດສອບເລີ່ມຕົ້ນທີ່ຈຸດສັກຢາເພື່ອຕິດຕາມຄວາມຄືບໜ້າຂອງບາດແຜຕາມຊ່ອງຂໍ້ ແລະ ຂໍ້ຕໍ່. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ໄລຍະຫ່າງຂອງບາດແຜຈາກຈຸດສັກຢາໄປຫາຈຸດທີ່ໄກທີ່ສຸດຕາມລຳຕົ້ນ ຫຼື ກິ່ງງ່າໄດ້ຖືກວັດແທກ ແລະ ຄະແນນ 1–9 ໄດ້ຖືກກຳນົດໂດຍອີງໃສ່ສະຖານທີ່ຂອງບາດແຜ, ບ່ອນທີ່ (1) ຊີ້ບອກວ່າບໍ່ມີການຕິດເຊື້ອທີ່ເຫັນໄດ້ໃກ້ກັບຈຸດສັກຢາ ແລະ (2–9) ຊີ້ບອກເຖິງການເພີ່ມຂຶ້ນເທື່ອລະກ້າວຂອງຂະໜາດບາດແຜ ແລະ ຄວາມຄືບໜ້າຕາມຂໍ້/ຊ່ອງຂໍ້ (ຕາຕະລາງເສີມ S2). ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ຄວາມເຂັ້ມຂອງການຕິດເຊື້ອລາຂາວໄດ້ຖືກປ່ຽນເປັນເປີເຊັນໂດຍໃຊ້ສູດ 2:
ນອກຈາກນັ້ນ, ພື້ນທີ່ພາຍໃຕ້ເສັ້ນໂຄ້ງຄວາມຄືບໜ້າຂອງພະຍາດ (AUDPC) ໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ໂດຍໃຊ້ສູດ (Shaner ແລະ Finney, 1977), ເຊິ່ງບໍ່ດົນມານີ້ໄດ້ຖືກດັດແປງສຳລັບການເນົ່າເປື່ອຍຂາວຂອງຖົ່ວທຳມະດາ (Chauhan et al., 2020) ໂດຍໃຊ້ສົມຜົນ 3:
ບ່ອນທີ່ Yi = ຄວາມຮຸນແຮງຂອງພະຍາດໃນເວລາ ti, Yi+1 = ຄວາມຮຸນແຮງຂອງພະຍາດໃນເວລາຕໍ່ໄປ ti+1, ti = ເວລາຂອງການວັດແທກຄັ້ງທຳອິດ (ເປັນມື້), ti+1 = ເວລາຂອງການວັດແທກຄັ້ງຕໍ່ໄປ (ເປັນມື້), n = ຈຳນວນຈຸດເວລາທັງໝົດ ຫຼື ຈຸດສັງເກດ. ຕົວກຳນົດການເຕີບໂຕຂອງຕົ້ນຖົ່ວ ລວມທັງຄວາມສູງຂອງຕົ້ນໄມ້ (ຊມ), ຈຳນວນກິ່ງງ່າຕໍ່ຕົ້ນ, ແລະ ຈຳນວນໃບຕໍ່ຕົ້ນ ໄດ້ຖືກບັນທຶກໄວ້ທຸກໆອາທິດເປັນເວລາ 21 ມື້ ໃນສຳເນົາທາງຊີວະພາບທັງໝົດ.
ໃນແຕ່ລະສຳເນົາທາງຊີວະວິທະຍາ, ຕົວຢ່າງໃບ (ໃບທີສອງ ແລະ ທີສາມທີ່ພັດທະນາເຕັມທີ່ຈາກດ້ານເທິງ) ໄດ້ຖືກເກັບກຳໃນມື້ທີ 45 ຫຼັງຈາກການປິ່ນປົວ (15 ມື້ຫຼັງຈາກການປິ່ນປົວຄັ້ງສຸດທ້າຍ). ແຕ່ລະສຳເນົາທາງຊີວະວິທະຍາປະກອບດ້ວຍຫ້າກະຖາງ (ສອງຕົ້ນຕໍ່ກະຖາງ). ເນື້ອເຍື່ອທີ່ບົດແລ້ວປະມານ 500 ມກ ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການສະກັດເອົາເມັດສີສັງເຄາະແສງ (chlorophyll a, chlorophyll b ແລະ carotenoids) ໂດຍໃຊ້ acetone 80% ທີ່ 4 °C ໃນຄວາມມືດ. ຫຼັງຈາກ 24 ຊົ່ວໂມງ, ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກປั่นແຍກ ແລະ ນໍ້າໃຕ້ດິນໄດ້ຖືກເກັບກຳເພື່ອກໍານົດປະລິມານ chlorophyll a, chlorophyll b ແລະ carotenoid ໂດຍໃຊ້ເຄື່ອງວັດແທກສີ UV-160A (Shimadzu Corporation, ຍີ່ປຸ່ນ) ຕາມວິທີການ (Lichtenthaler, 1987) ໂດຍການວັດແທກການດູດຊຶມທີ່ຄວາມຍາວຄື້ນທີ່ແຕກຕ່າງກັນສາມແບບ (A470, A646 ແລະ A663 nm). ສຸດທ້າຍ, ປະລິມານຂອງເມັດສີສັງເຄາະແສງໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ໂດຍໃຊ້ສູດຕໍ່ໄປນີ້ 4–6 ທີ່ອະທິບາຍໂດຍ Lichtenthaler (1987).
ຫຼັງຈາກການປະຕິບັດ 72 ຊົ່ວໂມງ (hpt), ໃບ (ໃບທີສອງ ແລະ ທີສາມທີ່ພັດທະນາເຕັມທີ່ຈາກດ້ານເທິງ) ໄດ້ຖືກເກັບມາຈາກແຕ່ລະສຳເນົາທາງຊີວະວິທະຍາ ສຳລັບການລະບຸຕຳແໜ່ງທາງຊີວະເຄມີໃນສະຖານທີ່ຂອງໄຮໂດຣເຈນເປີອອກໄຊ (H2O2) ແລະ ອະນຸພາກຊຸບເປີອອກໄຊ (O2•−). ແຕ່ລະສຳເນົາທາງຊີວະວິທະຍາປະກອບດ້ວຍຫ້າກະຖາງ (ສອງຕົ້ນຕໍ່ກະຖາງ). ແຕ່ລະສຳເນົາທາງຊີວະວິທະຍາໄດ້ຖືກວິເຄາະເປັນສອງຊ້ຳກັນ (ສອງສຳເນົາທາງເທັກນິກ) ເພື່ອຮັບປະກັນຄວາມຖືກຕ້ອງ, ຄວາມໜ້າເຊື່ອຖື ແລະ ຄວາມສາມາດໃນການຜະລິດຊ້ຳອີກຂອງວິທີການ. H2O2 ແລະ O2•− ໄດ້ຖືກກຳນົດໂດຍໃຊ້ 0.1% 3,3′-diaminobenzidine (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, ເຢຍລະມັນ) ຫຼື nitroblue tetrazolium (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, ເຢຍລະມັນ) ຕາມລຳດັບ, ໂດຍປະຕິບັດຕາມວິທີການທີ່ອະທິບາຍໂດຍ Romero-Puertas et al. (2004) ແລະ Adam et al. (1989) ດ້ວຍການດັດແປງເລັກນ້ອຍ. ສຳລັບການລະບຸຕຳແໜ່ງທາງຮິສໂຕເຄມີຂອງ H2O2 ໃນແຫຼ່ງດຽວກັນ, ໃບປິວໄດ້ຖືກແຊກຊຶມເຂົ້າສູນຍາກາດດ້ວຍ 0.1% DAB ໃນບັຟເຟີ Tris 10 mM (pH 7.8) ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນບົ່ມຢູ່ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງໃນແສງສະຫວ່າງເປັນເວລາ 60 ນາທີ. ໃບປິວໄດ້ຖືກຟອກໃນ TCA 0.15% (v/v) ໃນ ethanol:chloroform 4:1 (v/v) (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນຖືກນຳໄປຕາກແດດຈົນກວ່າມັນຈະມືດລົງ. ເຊັ່ນດຽວກັນ, ວາວໄດ້ຖືກແຊກຊຶມເຂົ້າສູນຍາກາດດ້ວຍບັຟເຟີໂພແທດຊຽມຟອສເຟດ 10 mM (pH 7.8) ທີ່ມີ HBT 0.1 w/v % ສຳລັບການລະບຸຕຳແໜ່ງທາງຮິສໂຕເຄມີຂອງ O2•− ໃນແຫຼ່ງດຽວກັນ. ໃບປິວໄດ້ຖືກບົ່ມຢູ່ໃນແສງສະຫວ່າງທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງເປັນເວລາ 20 ນາທີ, ຈາກນັ້ນຟອກຄືກັບຂ້າງເທິງ, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນຖືກສ່ອງແສງຈົນກວ່າຈຸດສີຟ້າເຂັ້ມ/ສີມ່ວງຈະປາກົດຂຶ້ນ. ຄວາມເຂັ້ມຂອງສີນ້ຳຕານ (ເປັນຕົວຊີ້ບອກ H2O2) ຫຼື ສີຟ້າ-ມ່ວງ (ເປັນຕົວຊີ້ບອກ O2•−) ທີ່ໄດ້ຮັບໄດ້ຖືກປະເມີນໂດຍໃຊ້ຊຸດປະມວນຜົນຮູບພາບ ImageJ ລຸ້ນ Fiji (http://fiji.sc; ເຂົ້າເບິ່ງໃນວັນທີ 7 ມີນາ 2024).
Malondialdehyde (MDA; ເປັນຕົວຊີ້ບອກຂອງການຜຸພັງໄຂມັນ) ໄດ້ຖືກກຳນົດຕາມວິທີການຂອງ Du ແລະ Bramlage (1992) ດ້ວຍການດັດແປງເລັກນ້ອຍ. ໃບຈາກແຕ່ລະສຳເນົາທາງຊີວະພາບ (ໃບທີສອງ ແລະ ທີສາມທີ່ພັດທະນາເຕັມທີ່ຈາກດ້ານເທິງ) ໄດ້ຖືກເກັບມາ 72 ຊົ່ວໂມງຫຼັງການປະຕິບັດ (hpt). ແຕ່ລະສຳເນົາທາງຊີວະພາບປະກອບມີຫ້າກະຖາງ (ສອງຕົ້ນຕໍ່ກະຖາງ). ແຕ່ລະສຳເນົາທາງຊີວະພາບໄດ້ຖືກວິເຄາະເປັນສອງຊ້ຳກັນ (ສອງສຳເນົາທາງເທັກນິກ) ເພື່ອຮັບປະກັນຄວາມຖືກຕ້ອງ, ຄວາມໜ້າເຊື່ອຖື ແລະ ຄວາມສາມາດໃນການຜະລິດຊ້ຳອີກຂອງວິທີການ. ໂດຍຫຍໍ້, ເນື້ອເຍື່ອໃບບົດ 0.5 g ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການສະກັດ MDA ດ້ວຍກົດ trichloroacetic 20% (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) ທີ່ມີ 0.01% butylated hydroxytoluene (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ປະລິມານ MDA ໃນນ້ຳເຊາະເທິງໄດ້ຖືກກຳນົດດ້ວຍວິທີການວັດແທກສີໂດຍການວັດແທກການດູດຊຶມທີ່ 532 ແລະ 600 nm ໂດຍໃຊ້ເຄື່ອງວັດແທກແສງ UV-160A (ບໍລິສັດ Shimadzu, ຍີ່ປຸ່ນ) ແລະ ຫຼັງຈາກນັ້ນສະແດງອອກເປັນ nmol g−1 FW.
ສຳລັບການປະເມີນສານຕ້ານອະນຸມູນອິດສະລະທີ່ບໍ່ແມ່ນເອນໄຊມ໌ ແລະ ສານຕ້ານອະນຸມູນອິດສະລະທີ່ມີເອນໄຊມ໌, ໃບ (ໃບທີສອງ ແລະ ທີສາມທີ່ພັດທະນາເຕັມທີ່ຈາກດ້ານເທິງ) ໄດ້ຖືກເກັບມາຈາກແຕ່ລະສຳເນົາທາງຊີວະພາບໃນເວລາ 72 ຊົ່ວໂມງຫຼັງການປິ່ນປົວ (hpt). ແຕ່ລະສຳເນົາທາງຊີວະພາບປະກອບດ້ວຍຫ້າກະຖາງ (ສອງຕົ້ນຕໍ່ກະຖາງ). ແຕ່ລະຕົວຢ່າງທາງຊີວະພາບໄດ້ຖືກວິເຄາະເປັນສອງຊຸດ (ສອງຕົວຢ່າງທາງວິຊາການ). ໃບສອງໃບຖືກບົດດ້ວຍໄນໂຕຣເຈນແຫຼວ ແລະ ນຳໃຊ້ໂດຍກົງສຳລັບການກຳນົດສານຕ້ານອະນຸມູນອິດສະລະທີ່ມີເອນໄຊມ໌ ແລະ ບໍ່ແມ່ນເອນໄຊມ໌, ກົດອະມິໂນທັງໝົດ, ປະລິມານໂປຣລີນ, ການສະແດງອອກຂອງ gene, ແລະ ການວັດແທກປະລິມານ oxalate.
ຟີນໍລິກທີ່ລະລາຍທັງໝົດໄດ້ຖືກກຳນົດໂດຍໃຊ້ນໍ້າຢາ Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ໂດຍມີການດັດແປງເລັກນ້ອຍຂອງວິທີການທີ່ອະທິບາຍໂດຍ Kahkonen et al. (1999). ໂດຍຫຍໍ້, ເນື້ອເຍື່ອໃບປະມານ 0.1 g ໄດ້ຖືກສະກັດດ້ວຍ 20 ml methanol 80% ໃນຄວາມມືດເປັນເວລາ 24 ຊົ່ວໂມງ ແລະ ນ້ຳທີ່ໄຫຼອອກມາຈາກນ້ຳໄດ້ຖືກເກັບຫຼັງຈາກການປั่นແຍກ. 0.1 ml ຂອງສານສະກັດຈາກຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກປະສົມກັບ 0.5 ml Folin-Ciocalteu reagent (10%), ສັ່ນເປັນເວລາ 30 ວິນາທີ ແລະ ປະໄວ້ໃນຄວາມມືດເປັນເວລາ 5 ນາທີ. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, 0.5 ml ຂອງສານລະລາຍໂຊດຽມຄາບອນເນດ 20% (Na2CO3; ບໍລິສັດຢາ ແລະ ເຄື່ອງໃຊ້ທາງການແພດ Al-Gomhoria, Cairo, ອີຢິບ) ໄດ້ຖືກເພີ່ມໃສ່ແຕ່ລະຫຼອດ, ປະສົມຢ່າງລະອຽດ ແລະ ບົ່ມຢູ່ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງໃນຄວາມມືດເປັນເວລາ 1 ຊົ່ວໂມງ. ຫຼັງຈາກການຟັກ, ການດູດຊຶມຂອງສ່ວນປະສົມປະຕິກິລິຍາໄດ້ຖືກວັດແທກຢູ່ທີ່ 765 nm ໂດຍໃຊ້ເຄື່ອງວັດແທກແສງ UV-160A (ບໍລິສັດ Shimadzu, ຍີ່ປຸ່ນ). ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງຟີນອນທີ່ລະລາຍທັງໝົດໃນສານສະກັດຈາກຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກກຳນົດໂດຍໃຊ້ເສັ້ນໂຄ້ງການປັບທຽບກົດ gallic (Fisher Scientific, Hampton, NH, ອາເມລິກາ) ແລະສະແດງອອກເປັນມິນລີກຣາມຂອງອາຊິດ gallic ທຽບເທົ່າຕໍ່ກຣາມຂອງນ້ຳໜັກສົດ (mg GAE g-1 ນ້ຳໜັກສົດ).
ປະລິມານ flavonoid ທີ່ລະລາຍທັງໝົດໄດ້ຖືກກຳນົດຕາມວິທີການຂອງ Djeridane et al. (2006) ດ້ວຍການດັດແປງເລັກນ້ອຍ. ໂດຍຫຍໍ້, 0.3 ml ຂອງສານສະກັດຈາກ methanol ຂ້າງເທິງໄດ້ຖືກປະສົມກັບ 0.3 ml ຂອງສານລະລາຍອາລູມິນຽມຄລໍໄຣ 5% (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA), ຄົນຢ່າງແຮງ ແລະ ຫຼັງຈາກນັ້ນບົ່ມຢູ່ທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງເປັນເວລາ 5 ນາທີ, ຕາມດ້ວຍການເພີ່ມ 0.3 ml ຂອງສານລະລາຍໂພແທດຊຽມອາເຊເຕດ 10% (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt), ປະສົມຢ່າງລະອຽດ ແລະ ບົ່ມຢູ່ທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງເປັນເວລາ 30 ນາທີໃນຄວາມມືດ. ຫຼັງຈາກການບົ່ມ, ການດູດຊຶມຂອງສ່ວນປະສົມປະຕິກິລິຍາໄດ້ຖືກວັດແທກຢູ່ທີ່ 430 nm ໂດຍໃຊ້ເຄື່ອງວັດແທກແສງ UV-160A (Shimadzu Corporation, ຍີ່ປຸ່ນ). ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ flavonoid ທີ່ລະລາຍທັງໝົດໃນສານສະກັດຈາກຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກກຳນົດໂດຍໃຊ້ເສັ້ນໂຄ້ງການປັບຄ່າ rutin (TCI America, Portland, OR, USA) ແລະ ຫຼັງຈາກນັ້ນສະແດງອອກເປັນມິນລີກຣາມຂອງ rutin ທຽບເທົ່າຕໍ່ກຣາມຂອງນ້ຳໜັກສົດ (mg RE g-1 fresh weight).
ປະລິມານກົດອະມິໂນອິດສະຫຼະທັງໝົດຂອງໃບຖົ່ວໄດ້ຖືກກຳນົດໂດຍໃຊ້ຕົວເຮັດປະຕິກິລິຍາ ninhydrin ທີ່ຖືກດັດແປງ (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) ໂດຍອີງໃສ່ວິທີການທີ່ສະເໜີໂດຍ Yokoyama ແລະ Hiramatsu (2003) ແລະ ດັດແປງໂດຍ Sun et al. (2006). ໂດຍຫຍໍ້, ເນື້ອເຍື່ອດິນ 0.1 g ໄດ້ຖືກສະກັດດ້ວຍບັຟເຟີ pH 5.4, ແລະ 200 μL ຂອງນ້ຳຊຸບນ້ຳຕານໄດ້ຖືກປະຕິກິລິຍາກັບ 200 μL ຂອງ ninhydrin (2%) ແລະ 200 μL ຂອງ pyridine (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA), ບົ່ມໃນອ່າງນ້ຳຕົ້ມເປັນເວລາ 30 ນາທີ, ຫຼັງຈາກນັ້ນເຮັດໃຫ້ເຢັນ ແລະ ວັດແທກທີ່ 580 nm ໂດຍໃຊ້ເຄື່ອງວັດແທກແສງ UV-160A (Shimadzu Corporation, ຍີ່ປຸ່ນ). ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, proline ໄດ້ຖືກກຳນົດໂດຍວິທີ Bates (Bates et al., 1973). ໂປຣລີນໄດ້ຖືກສະກັດດ້ວຍກົດຊູນໂຟຊາລີຊີລິກ 3% (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) ແລະຫຼັງຈາກການປั่นແຍກ, ນ້ຳໃຕ້ຜິວ 0.5 ມລ ໄດ້ຖືກປະສົມກັບກົດອາເຊຕິກນ້ຳກ້ອນ 1 ມລ (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) ແລະສານນິນໄຮດຣິນ, ບົ່ມຢູ່ທີ່ 90°C ເປັນເວລາ 45 ນາທີ, ເຮັດໃຫ້ເຢັນ ແລະວັດແທກທີ່ 520 nm ໂດຍໃຊ້ເຄື່ອງວັດແທກສະເປກໂຕຣໂຟໂຕມິເຕີດຽວກັນກັບຂ້າງເທິງ. ກົດອະມິໂນອິດສະຫຼະທັງໝົດ ແລະໂປຣລີນໃນສານສະກັດຈາກໃບໄດ້ຖືກກຳນົດໂດຍໃຊ້ເສັ້ນໂຄ້ງການປັບທຽບກລີຊີນ ແລະໂປຣລີນ (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) ຕາມລຳດັບ, ແລະສະແດງເປັນມກ/ກ ນ້ຳໜັກສົດ.
ເພື່ອກຳນົດກິດຈະກຳຂອງເອນໄຊມ໌ຂອງເອນໄຊມ໌ຕ້ານອະນຸມູນອິດສະລະ, ເນື້ອເຍື່ອປະມານ 500 ມກ ໄດ້ຖືກສະກັດດ້ວຍ 3 ml ຂອງບັຟເຟີ Tris 50 mM (pH 7.8) ທີ່ມີ 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ແລະ 7.5% polyvinylpyrrolidone (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), ປั่นແຍກທີ່ 10,000 × g ເປັນເວລາ 20 ນາທີພາຍໃຕ້ຕູ້ເຢັນ (4 °C), ແລະເກັບກຳສ່ວນເທິງ (ສານສະກັດຈາກເອນໄຊມ໌ດິບ) (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). ຫຼັງຈາກນັ້ນ, Catalase (CAT) ໄດ້ຖືກປະຕິກິລິຍາກັບ 2 ml ຂອງບັຟເຟີໂຊດຽມຟອສເຟດ 0.1 M (pH 6.5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ແລະ 100 μl ຂອງສານລະລາຍ H2O2 269 mM ເພື່ອກໍານົດກິດຈະກໍາຂອງເອນໄຊມ໌ຕາມວິທີການຂອງ Aebi (1984) ດ້ວຍການດັດແປງເລັກນ້ອຍ (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). ກິດຈະກໍາຂອງເອນໄຊມ໌ peroxidase (POX) ທີ່ຂຶ້ນກັບ Guaiacol ໄດ້ຖືກກໍານົດໂດຍໃຊ້ວິທີການຂອງ Harrach et al. (2009). (2008) ດ້ວຍການດັດແປງເລັກນ້ອຍ (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) ແລະກິດຈະກຳຂອງເອນໄຊມ໌ຂອງ polyphenol oxidase (PPO) ໄດ້ຖືກກຳນົດຫຼັງຈາກປະຕິກິລິຍາກັບ 2.2 ml ຂອງບັຟເຟີໂຊດຽມຟອສເຟດ 100 mM (pH 6.0), 100 μl ຂອງ guaiacol (ສານເຄມີ TCI, Portland, OR, USA) ແລະ 100 μl ຂອງ 12 mM H2O2. ວິທີການດັ່ງກ່າວໄດ້ຖືກດັດແປງເລັກນ້ອຍຈາກ (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). ການທົດສອບໄດ້ຖືກປະຕິບັດຫຼັງຈາກປະຕິກິລິຍາກັບ 3 ml ຂອງສານລະລາຍ catechol (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0.01 M) ທີ່ກະກຽມໃໝ່ໆໃນບັຟເຟີຟອສເຟດ 0.1 M (pH 6.0). ກິດຈະກຳ CAT ໄດ້ຖືກວັດແທກໂດຍການຕິດຕາມການເນົ່າເປື່ອຍຂອງ H2O2 ທີ່ 240 nm (A240), ກິດຈະກຳ POX ໄດ້ຖືກວັດແທກໂດຍການຕິດຕາມການເພີ່ມຂຶ້ນຂອງການດູດຊຶມທີ່ 436 nm (A436), ແລະ ກິດຈະກຳ PPO ໄດ້ຖືກວັດແທກໂດຍການບັນທຶກການປ່ຽນແປງຂອງການດູດຊຶມທີ່ 495 nm (A495) ທຸກໆ 30 ວິນາທີ ເປັນເວລາ 3 ນາທີ ໂດຍໃຊ້ເຄື່ອງວັດແທກສະເປກໂຕຣໂຟໂຕມິເຕີ UV-160A (Shimadzu, ຍີ່ປຸ່ນ).
RT-PCR ແບບເວລາຈິງໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອກວດຫາລະດັບການຖອດລະຫັດຂອງສາມ gene ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບສານຕ້ານອະນຸມູນອິດສະລະ, ລວມທັງ peroxisomal catalase (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1), superoxide dismutase (PvSOD; GenBank Accession No. XM_068639556.1), ແລະ glutathione reductase (PvGR; GenBank Accession No. KY195009.1), ໃນໃບຖົ່ວ (ໃບທີສອງ ແລະ ທີສາມທີ່ພັດທະນາເຕັມທີ່ຈາກດ້ານເທິງ) 72 ຊົ່ວໂມງຫຼັງຈາກການປິ່ນປົວຄັ້ງສຸດທ້າຍ. ໂດຍຫຍໍ້, RNA ໄດ້ຖືກແຍກອອກໂດຍໃຊ້ຊຸດສະກັດ RNA ທັງໝົດ Simply P (ໝາຍເລກໝວດໝູ່ BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, ຈີນ) ຕາມໂປໂຕຄອນຂອງຜູ້ຜະລິດ. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, cDNA ໄດ້ຖືກສັງເຄາະໂດຍໃຊ້ຊຸດສັງເຄາະ cDNA TOP script™ ຕາມຄຳແນະນຳຂອງຜູ້ຜະລິດ. ລຳດັບ primer ຂອງສາມ gene ຂ້າງເທິງນີ້ແມ່ນລະບຸໄວ້ໃນຕາຕະລາງເສີມ S3. PvActin-3 (ເລກທີ່ເຂົ້າເຖິງ GenBank: XM_068616709.1) ຖືກນໍາໃຊ້ເປັນ gene housekeeping ແລະ ການສະແດງອອກຂອງ gene ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ໂດຍໃຊ້ວິທີ 2-ΔΔCT (Livak ແລະ Schmittgen, 2001). ຄວາມໝັ້ນຄົງຂອງ Actin ພາຍໃຕ້ຄວາມກົດດັນທາງຊີວະພາບ (ການພົວພັນທີ່ບໍ່ເຂົ້າກັນໄດ້ລະຫວ່າງພືດຕະກຸນຖົ່ວທົ່ວໄປ ແລະ ເຊື້ອເຫັດ anthracnose Colletotrichum lindemuthianum) ແລະ ຄວາມກົດດັນທາງຊີວະພາບ (ໄພແຫ້ງແລ້ງ, ຄວາມເຄັມ, ອຸນຫະພູມຕໍ່າ) ໄດ້ຖືກສະແດງໃຫ້ເຫັນ (Borges et al., 2012).
ໃນເບື້ອງຕົ້ນພວກເຮົາໄດ້ປະຕິບັດການວິເຄາະ silico ທົ່ວຈີໂນມຂອງໂປຣຕີນ oxaloacetate acetylhydrolase (OAH) ໃນ S. sclerotiorum ໂດຍໃຊ້ເຄື່ອງມື BLAST ໂປຣຕີນ-ໂປຣຕີນ (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). ໂດຍຫຍໍ້, ພວກເຮົາໄດ້ໃຊ້ OAH ຈາກ Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxide: 1191702; ເລກທີ່ເຂົ້າເຖິງ GenBank XP_040799428.1; ກົດອະມິໂນ 342) ແລະ Penicillium lagena (PlOAH; taxide: 94218; ເລກທີ່ເຂົ້າເຖິງ GenBank XP_056833920.1; ກົດອະມິໂນ 316) ເປັນລຳດັບການສອບຖາມເພື່ອສ້າງແຜນທີ່ໂປຣຕີນ homologous ໃນ S. sclerotiorum (taxide: 5180). BLASTp ໄດ້ຖືກປະຕິບັດຕໍ່ກັບຂໍ້ມູນຈີໂນມ S. sclerotiorum ທີ່ມີຢູ່ລ່າສຸດໃນ GenBank ໃນເວັບໄຊທ໌ສູນແຫ່ງຊາດເພື່ອຂໍ້ມູນຂ່າວສານດ້ານຊີວະເຕັກໂນໂລຊີ (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
ນອກຈາກນັ້ນ, ພັນທຸກໍາ OAH ທີ່ຄາດຄະເນໄວ້ຈາກ S. sclerotiorum (SsOAH) ແລະ ການວິເຄາະວິວັດທະນາການ ແລະ ຕົ້ນໄມ້ phylogenetic ຂອງ AfOAH ຈາກ A. fijiensis CBS 313.89 ແລະ PlOAH ຈາກ P. lagena ໄດ້ຖືກອະນຸມານໂດຍໃຊ້ວິທີການຄວາມເປັນໄປໄດ້ສູງສຸດໃນ MEGA11 (Tamura et al., 2021) ແລະ ຮູບແບບທີ່ອີງໃສ່ matrix JTT (Jones et al., 1992). ຕົ້ນໄມ້ phylogenetic ໄດ້ຖືກລວມເຂົ້າກັບການວິເຄາະການຈັດລຽນຫຼາຍອັນຂອງລໍາດັບໂປຣຕີນຂອງພັນທຸກໍາ OAH ທີ່ຄາດຄະເນໄວ້ທັງໝົດ (SsOAH) ຈາກ S. sclerotiorum ແລະ ລໍາດັບການສອບຖາມໂດຍໃຊ້ Constraint-Based Alignment Tool (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos ແລະ Agarwala, 2007). ນອກຈາກນັ້ນ, ລຳດັບກົດອະມິໂນທີ່ກົງກັນທີ່ດີທີ່ສຸດຂອງ SsOAH ຈາກ S. sclerotiorum ໄດ້ຖືກຈັດລຽງກັບລຳດັບການສອບຖາມ (AfOAH ແລະ PlOAH) (Larkin et al., 2007) ໂດຍໃຊ້ ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), ແລະ ພາກພື້ນທີ່ຖືກອະນຸລັກໄວ້ໃນການຈັດລຽງໄດ້ຖືກເບິ່ງເຫັນໂດຍໃຊ້ເຄື່ອງມື ESPript (ເວີຊັນ 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
ນອກຈາກນັ້ນ, ໂດເມນຕົວແທນທີ່ຄາດຄະເນໄວ້ ແລະ ສະຖານທີ່ອະນຸລັກຂອງ S. sclerotiorum SsOAH ໄດ້ຖືກຈັດປະເພດເປັນຄອບຄົວທີ່ແຕກຕ່າງກັນໂດຍໃຊ້ເຄື່ອງມື InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). ສຸດທ້າຍ, ການສ້າງແບບຈຳລອງໂຄງສ້າງສາມມິຕິ (3D) ຂອງ S. sclerotiorum SsOAH ທີ່ຄາດຄະເນໄວ້ໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ Protein Homology/Analogy Recognition Engine (Phyre2 server version 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) ແລະ ກວດສອບຄວາມຖືກຕ້ອງໂດຍໃຊ້ເຊີບເວີ SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). ໂຄງສ້າງສາມມິຕິທີ່ຄາດຄະເນໄວ້ (ຮູບແບບ PDB) ໄດ້ຖືກເບິ່ງເຫັນໄດ້ແບບໂຕ້ຕອບໂດຍໃຊ້ແພັກເກດ UCSF-Chimera (ເວີຊັນ 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen et al., 2004).
PCR ທີ່ມີການເຍືອງແສງແບບປະລິມານໃນເວລາຈິງໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອກໍານົດລະດັບການຖອດລະຫັດຂອງ oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH; ເລກທີ່ເຂົ້າເຖິງ GenBank: XM_001590428.1) ໃນເຊື້ອລາຂອງ Sclerotinia sclerotiorum. ໂດຍຫຍໍ້, S. sclerotiorum ໄດ້ຖືກສັກເຂົ້າໄປໃນຂວດທີ່ມີ PDB ແລະວາງໄວ້ໃນຕູ້ອົບ (ຮຸ່ນ: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) ທີ່ອຸນຫະພູມ 25 ± 2°C ເປັນເວລາ 24 ຊົ່ວໂມງ ທີ່ 150 rpm ແລະໃນຄວາມມືດຄົງທີ່ (24 ຊົ່ວໂມງ) ເພື່ອກະຕຸ້ນການເຕີບໂຕຂອງເຊື້ອລາ. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ຈຸລັງໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ L-ornithine ແລະຢາຂ້າເຊື້ອລາ Rizolex-T ທີ່ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ IC50 ສຸດທ້າຍ (ປະມານ 40 ແລະ 3.2 ມກ/ລິດ, ຕາມລໍາດັບ) ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນเพาะเลี้ยงອີກ 24 ຊົ່ວໂມງພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂດຽວກັນ. ຫຼັງຈາກການຟັກ, ເຊື້ອເຫັດໄດ້ຖືກປั่นແຍກທີ່ 2500 rpm ເປັນເວລາ 5 ນາທີ ແລະ ສ່ວນເທິງຂອງເຍື່ອຫຸ້ມເຊລຽມ (ເຊື້ອເຫັດ) ໄດ້ຖືກເກັບກຳມາເພື່ອການວິເຄາະການສະແດງອອກຂອງເຊື້ອ. ໃນທຳນອງດຽວກັນ, ເຊື້ອເຫັດໄດ້ຖືກເກັບກຳຢູ່ທີ່ 0, 24, 48, 72, 96, ແລະ 120 ຊົ່ວໂມງຫຼັງຈາກການຕິດເຊື້ອຈາກພືດທີ່ຕິດເຊື້ອທີ່ໄດ້ສ້າງເຊື້ອລາສີຂາວ ແລະ ເຊື້ອຝ້າຍຢູ່ເທິງໜ້າຜິວຂອງເນື້ອເຍື່ອທີ່ຕິດເຊື້ອ. RNA ໄດ້ຖືກສະກັດຈາກເຊື້ອເຫັດ ແລະ ຫຼັງຈາກນັ້ນ cDNA ໄດ້ຖືກສັງເຄາະຕາມທີ່ໄດ້ອະທິບາຍຂ້າງເທິງ. ລຳດັບ primer ສຳລັບ SsOAH ແມ່ນລະບຸໄວ້ໃນຕາຕະລາງເສີມ S3. SsActin (ເລກທີ່ເຂົ້າເຖິງ GenBank: XM_001589919.1) ຖືກນໍາໃຊ້ເປັນເຊື້ອ housekeeping, ແລະການສະແດງອອກຂອງເຊື້ອທີ່ກ່ຽວຂ້ອງໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ໂດຍໃຊ້ວິທີ 2-ΔΔCT (Livak ແລະ Schmittgen, 2001).
ກົດອັອກຊາລິກໄດ້ຖືກກຳນົດໃນນ້ຳຕົ້ມເດັກສ໌ໂຕຣສມັນຕົ້ນ (PDB) ແລະຕົວຢ່າງພືດທີ່ມີເຊື້ອເຫັດ Sclerotinia sclerotiorum ຕາມວິທີການຂອງ Xu ແລະ Zhang (2000) ດ້ວຍການດັດແປງເລັກນ້ອຍ. ໂດຍຫຍໍ້, ເຊື້ອ S. sclerotiorum ໄດ້ຖືກເຊື້ອເຂົ້າໄປໃນຂວດທີ່ມີ PDB ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນນຳໄປเพาะเลี้ยงໃນຕູ້ອົບແຫ້ງ (ຮຸ່ນ I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) ທີ່ 150 rpm ທີ່ 25 ± 2 °C ເປັນເວລາ 3–5 ມື້ໃນຄວາມມືດຄົງທີ່ (24 ຊົ່ວໂມງ) ເພື່ອກະຕຸ້ນການເຕີບໂຕຂອງເຊື້ອເຫັດ. ຫຼັງຈາກການเพาะเลี้ยง, ເຊື້ອເຫັດໄດ້ຖືກກັ່ນຕອງຜ່ານເຈ້ຍກອງ Whatman #1 ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນຖືກປั่นແຍກທີ່ 2500 rpm ເປັນເວລາ 5 ນາທີເພື່ອກຳຈັດເຊື້ອເຫັດທີ່ເຫຼືອ. ສານລະລາຍເທິງໜ້າດິນໄດ້ຖືກເກັບກຳ ແລະເກັບຮັກສາໄວ້ທີ່ 4°C ສຳລັບການກຳນົດປະລິມານຂອງອົກຊາເລດຕື່ມອີກ. ສຳລັບການກະກຽມຕົວຢ່າງພືດ, ຊິ້ນສ່ວນເນື້ອເຍື່ອພືດປະມານ 0.1 g ໄດ້ຖືກສະກັດອອກສາມເທື່ອດ້ວຍນ້ຳກັ່ນ (2 ml ໃນແຕ່ລະຄັ້ງ). ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກປั่นແຍກດ້ວຍຄວາມໄວ 2500 rpm ເປັນເວລາ 5 ນາທີ, ສ່ວນທີ່ເປັນນ້ຳໃສໄດ້ຖືກກັ່ນຕອງແຫ້ງຜ່ານເຈ້ຍກອງ Whatman ເລກທີ 1 ແລະ ເກັບມາວິເຄາະຕື່ມອີກ.
ສຳລັບການວິເຄາະດ້ານປະລິມານຂອງກົດອົກຊາລິກ, ສ່ວນປະສົມປະຕິກິລິຍາໄດ້ຖືກກະກຽມໃນທໍ່ແກ້ວທີ່ມີຈຸກຕາມລຳດັບຕໍ່ໄປນີ້: ຕົວຢ່າງ 0.2 ມລ (ຫຼືສານລະລາຍເຊື້ອ PDB ຫຼື ສານລະລາຍມາດຕະຖານກົດອົກຊາລິກ), ສີຟ້າ bromophenol 0.11 ມລ (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, USA), ກົດຊູນຟູຣິກ 1 M (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) 0.198 ມລ ແລະ ໂພແທດຊຽມໄດໂຄຣເມດ 100 mM (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, USA), ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນສານລະລາຍໄດ້ຖືກລະລາຍເປັນ 4.8 ມລ ດ້ວຍນ້ຳກັ່ນ, ປະສົມຢ່າງແຮງ ແລະ ວາງລົງໃນອ່າງນ້ຳ 60 °C ທັນທີ. ຫຼັງຈາກ 10 ນາທີ, ປະຕິກິລິຍາໄດ້ຖືກຢຸດໂດຍການເພີ່ມສານລະລາຍໂຊດຽມໄຮດຣອກໄຊດ໌ 0.5 ມລ (NaOH; 0.75 M). ການດູດຊຶມ (A600) ຂອງສ່ວນປະສົມປະຕິກິລິຍາໄດ້ຖືກວັດແທກຢູ່ທີ່ 600 nm ໂດຍໃຊ້ເຄື່ອງວັດແທກແສງ UV-160 (ບໍລິສັດ Shimadzu, ຍີ່ປຸ່ນ). PDB ແລະນ້ຳກັ່ນໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເປັນຕົວຄວບຄຸມສໍາລັບການວັດປະລິມານຂອງການກັ່ນຕອງເຊື້ອເຫັດ ແລະຕົວຢ່າງພືດຕາມລໍາດັບ. ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງກົດ oxalic ໃນການກັ່ນຕອງເຊື້ອເຫັດ, ສະແດງເປັນໄມໂຄຣກຣາມຂອງກົດ oxalic ຕໍ່ມິນລີລິດຂອງສື່ກາງ PDB (μg.mL−1), ແລະໃນສານສະກັດຈາກໃບ, ສະແດງເປັນໄມໂຄຣກຣາມຂອງກົດ oxalic ຕໍ່ກຣາມຂອງນ້ຳໜັກສົດ (μg.g−1 FW), ໄດ້ຖືກກໍານົດໂດຍໃຊ້ເສັ້ນໂຄ້ງການປັບທຽບກົດ oxalic (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, ສະຫະລັດອາເມລິກາ).
ຕະຫຼອດການສຶກສາ, ການທົດລອງທັງໝົດໄດ້ຖືກອອກແບບໃນແບບສຸ່ມທີ່ສົມບູນແບບ (CRD) ໂດຍມີຫົກສຳເນົາທາງຊີວະພາບຕໍ່ການປິ່ນປົວ ແລະ ຫ້າກະຖາງຕໍ່ສຳເນົາທາງຊີວະພາບ (ສອງຕົ້ນໄມ້ຕໍ່ກະຖາງ) ເວັ້ນເສຍແຕ່ຈະມີການລະບຸໄວ້ເປັນຢ່າງອື່ນ. ສຳເນົາທາງຊີວະພາບໄດ້ຖືກວິເຄາະເປັນສອງສຳເນົາ (ສອງສຳເນົາທາງວິຊາການ). ສຳເນົາທາງວິຊາການໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອກວດສອບຄວາມສາມາດໃນການຜະລິດຊ້ຳຂອງການທົດລອງດຽວກັນ ແຕ່ບໍ່ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ໃນການວິເຄາະທາງສະຖິຕິເພື່ອຫຼີກເວັ້ນການສຳເນົາທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງ. ຂໍ້ມູນໄດ້ຖືກວິເຄາະທາງສະຖິຕິໂດຍໃຊ້ການວິເຄາະຄວາມແปรປ່ວນ (ANOVA) ຕາມດ້ວຍການທົດສອບຄວາມແຕກຕ່າງທີ່ສຳຄັນຂອງ Tukey-Kramer (HSD) (p ≤ 0.05). ສໍາລັບການທົດລອງໃນຫຼອດທົດລອງ, ຄ່າ IC50 ແລະ IC99 ໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ໂດຍໃຊ້ຮູບແບບ probit ແລະ ໄລຍະຄວາມເຊື່ອໝັ້ນ 95% ໄດ້ຖືກຄິດໄລ່.
ການເກັບກຳເຊື້ອທັງໝົດສີ່ຊະນິດຈາກທົ່ງຖົ່ວເຫຼືອງທີ່ແຕກຕ່າງກັນໃນເຂດ El Ghabiya, ປະເທດເອຢິບ. ໃນອາຫານ PDA, ເຊື້ອທັງໝົດໄດ້ຜະລິດເຊື້ອເຫັດສີຂາວຄຣີມທີ່ປ່ຽນເປັນສີຂາວອ່ອນໆຢ່າງໄວວາ (ຮູບທີ 1A) ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນເປັນສີເບຈ ຫຼື ສີນ້ຳຕານໃນໄລຍະ sclerotium. Sclerotia ມັກຈະໜາແໜ້ນ, ສີດຳ, ຮູບຊົງກົມ ຫຼື ຮູບຮ່າງບໍ່ສະໝໍ່າສະເໝີ, ຍາວ 5.2 ຫາ 7.7 ມມ ແລະ ເສັ້ນຜ່າສູນກາງ 3.4 ຫາ 5.3 ມມ (ຮູບທີ 1B). ເຖິງແມ່ນວ່າເຊື້ອທັງສີ່ຊະນິດໄດ້ພັດທະນາຮູບແບບຂອງ sclerotia ຢູ່ແຄມຂອງອາຫານເພາະພັນຫຼັງຈາກ 10-12 ມື້ຂອງການຟັກທີ່ອຸນຫະພູມ 25 ± 2 °C (ຮູບທີ 1A), ຈຳນວນ sclerotia ຕໍ່ແຜ່ນແມ່ນແຕກຕ່າງກັນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ (P < 0.001), ໂດຍເຊື້ອທີ 3 ມີຈຳນວນ sclerotia ສູງສຸດ (32.33 ± 1.53 sclerotia ຕໍ່ແຜ່ນ; ຮູບທີ 1C). ໃນລັກສະນະດຽວກັນ, ເຊື້ອແບັກທີເຣັຍ #3 ໄດ້ຜະລິດກົດ oxalic ຫຼາຍກ່ວາເຊື້ອແບັກທີເຣັຍອື່ນໆ (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; ຮູບທີ 1D). ເຊື້ອແບັກທີເຣັຍ #3 ສະແດງໃຫ້ເຫັນລັກສະນະທາງດ້ານຮູບຮ່າງ ແລະ ກ້ອງຈຸລະທັດທົ່ວໄປຂອງເຊື້ອເຫັດ Sclerotinia sclerotiorum ທີ່ເຮັດໃຫ້ເກີດພະຍາດພືດ. ຕົວຢ່າງ, ໃນ PDA, ໂຄໂລນີຂອງເຊື້ອແບັກທີເຣັຍ #3 ເຕີບໃຫຍ່ຢ່າງໄວວາ, ມີສີຂາວຄຣີມ (ຮູບທີ 1A), ສີເບຈ ຫຼື ສີນ້ຳຕານເຫຼືອງອ່ອນ, ແລະ ຕ້ອງໃຊ້ເວລາ 6-7 ມື້ທີ່ອຸນຫະພູມ 25 ± 2°C ເພື່ອປົກຄຸມໜ້າດິນຂອງແຜ່ນທີ່ມີເສັ້ນຜ່າສູນກາງ 9 ຊມ. ໂດຍອີງໃສ່ລັກສະນະທາງດ້ານຮູບຮ່າງ ແລະ ກ້ອງຈຸລະທັດຂ້າງເທິງ, ເຊື້ອແບັກທີເຣັຍ #3 ໄດ້ຖືກລະບຸວ່າເປັນ Sclerotinia sclerotiorum.
ຮູບທີ 1. ລັກສະນະ ແລະ ການເກີດພະຍາດຂອງເຊື້ອ S. sclerotiorum ຈາກພືດຕະກຸນຖົ່ວທົ່ວໄປ. (A) ການເຕີບໃຫຍ່ຂອງເຊື້ອເຫັດຂອງເຊື້ອ S. sclerotiorum ສີ່ຊະນິດໃນອາຫານກາງ PDA, (B) sclerotia ຂອງເຊື້ອ S. sclerotiorum ສີ່ຊະນິດ, (C) ຈຳນວນຂອງ sclerotia (ຕໍ່ແຜ່ນ), (D) ການຫຼั่งກົດ oxalic ໃນອາຫານກາງ PDB (μg.mL−1), ແລະ (E) ຄວາມຮຸນແຮງຂອງພະຍາດ (%) ຂອງເຊື້ອ S. sclerotiorum ສີ່ຊະນິດໃນພືດຕະກຸນຖົ່ວທີ່ມີຄວາມສ່ຽງທາງການຄ້າ Giza 3 ພາຍໃຕ້ສະພາບເຮືອນແກ້ວ. ຄ່າສະແດງເຖິງຄ່າສະເລ່ຍ ± SD ຂອງຫ້າສຳເນົາທາງຊີວະພາບ (n = 5). ຕົວອັກສອນທີ່ແຕກຕ່າງກັນຊີ້ບອກເຖິງຄວາມແຕກຕ່າງທີ່ສຳຄັນທາງສະຖິຕິລະຫວ່າງການປິ່ນປົວ (p < 0.05). (F–H) ອາການຂອງເຊື້ອລາສີຂາວທົ່ວໄປປາກົດຢູ່ເທິງລຳຕົ້ນ ແລະ ຕົ້ນ siliques ຂ້າງເທິງດິນ, ຕາມລຳດັບ, 10 ມື້ຫຼັງຈາກການຕິດເຊື້ອດ້ວຍເຊື້ອ #3 (dpi). (I) ການວິເຄາະວິວັດທະນາການຂອງພາກພື້ນຖອດລະຫັດພາຍໃນ (ITS) ຂອງເຊື້ອ S. sclerotiorum isolate #3 ໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ວິທີການຄວາມມັກສູງສຸດ ແລະ ປຽບທຽບກັບເຊື້ອອ້າງອີງ 20 ຊະນິດ/ເຊື້ອພັນທີ່ໄດ້ມາຈາກຖານຂໍ້ມູນສູນຂໍ້ມູນຂ່າວສານຊີວະເຕັກໂນໂລຊີແຫ່ງຊາດ (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). ຕົວເລກຂ້າງເທິງເສັ້ນກຸ່ມສະແດງເຖິງການຄອບຄຸມພາກພື້ນ (%), ແລະ ຕົວເລກຂ້າງລຸ່ມເສັ້ນກຸ່ມສະແດງເຖິງຄວາມຍາວຂອງກິ່ງງ່າ.
ນອກຈາກນັ້ນ, ເພື່ອຢືນຢັນການເປັນພະຍາດ, ເຊື້ອເຫັດ S. sclerotiorum ທີ່ໄດ້ຮັບສີ່ຊະນິດໄດ້ຖືກນຳໃຊ້ເພື່ອສັກເຊື້ອໃຫ້ຖົ່ວພັນ Giza 3 ທີ່ມີຄວາມສ່ຽງຕໍ່ການຄ້າພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂເຮືອນແກ້ວ, ເຊິ່ງສອດຄ່ອງກັບສົມມຸດຕິຖານຂອງ Koch (ຮູບທີ 1E). ເຖິງແມ່ນວ່າເຊື້ອເຫັດທີ່ໄດ້ຮັບທັງໝົດແມ່ນເຊື້ອພະຍາດ ແລະ ສາມາດຕິດເຊື້ອຖົ່ວຂຽວ (cv. Giza 3), ເຊິ່ງເຮັດໃຫ້ເກີດອາການເຊື້ອລາສີຂາວທົ່ວໄປໃນທຸກສ່ວນທີ່ຢູ່ເໜືອດິນ (ຮູບທີ 1F), ໂດຍສະເພາະຢູ່ຕາມລຳຕົ້ນ (ຮູບທີ 1G) ແລະ ຝັກ (ຮູບທີ 1H) ໃນເວລາ 10 ມື້ຫຼັງຈາກສັກເຊື້ອ (dpi), ເຊື້ອເຫັດ 3 ແມ່ນເຊື້ອເຫັດທີ່ຮຸນແຮງທີ່ສຸດໃນສອງການທົດລອງເອກະລາດ. ເຊື້ອເຫັດ 3 ມີຄວາມຮຸນແຮງຂອງພະຍາດສູງສຸດ (%) ໃນຕົ້ນຖົ່ວ (24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0, ແລະ 76.7 ± 3.1 ໃນເວລາ 7, 14, ແລະ 21 ມື້ຫຼັງຈາກຕິດເຊື້ອຕາມລຳດັບ; ຮູບທີ 1F).
ການລະບຸເຊື້ອ S. sclerotiorum ຊະນິດທີ #3 ທີ່ຮຸກຮານທີ່ສຸດໄດ້ຮັບການຢືນຢັນຕື່ມອີກໂດຍອີງໃສ່ການຈັດລຳດັບຂອງຕົວແຍກພາຍໃນ (ITS) (ຮູບທີ 1I). ການວິເຄາະ phylogenetic ລະຫວ່າງເຊື້ອ #3 ແລະເຊື້ອ/ສາຍພັນອ້າງອີງ 20 ຊະນິດສະແດງໃຫ້ເຫັນຄວາມຄ້າຍຄືກັນສູງ (>99%) ລະຫວ່າງພວກມັນ. ມັນເປັນສິ່ງສຳຄັນທີ່ສັງເກດວ່າເຊື້ອ S. sclerotiorum ຊະນິດທີ #3 (533 bp) ມີຄວາມຄ້າຍຄືກັນສູງກັບເຊື້ອ S. sclerotiorum ຊະນິດ LPM36 ຂອງອາເມລິກາທີ່ແຍກອອກມາຈາກເມັດຖົ່ວແຫ້ງ (ເລກທີ່ເຂົ້າເຖິງ GenBank MK896659.1; 540 bp) ແລະເຊື້ອ S. sclerotiorum ຊະນິດຈີນ YKY211 (ເລກທີ່ເຂົ້າເຖິງ GenBank OR206374.1; 548 bp), ເຊິ່ງເປັນສາເຫດຂອງການເນົ່າເປື່ອຍຂອງລຳຕົ້ນສີມ່ວງ (Matthiola incana), ເຊິ່ງທັງໝົດຖືກຈັດກຸ່ມແຍກຕ່າງຫາກຢູ່ເທິງສຸດຂອງ dendrogram (ຮູບທີ 1I). ລຳດັບໃໝ່ໄດ້ຖືກຝາກໄວ້ໃນຖານຂໍ້ມູນ NCBI ແລະ ຕັ້ງຊື່ວ່າ "Sclerotinia sclerotiorum – isolate YN-25" (ເລກທີ່ເຂົ້າເຖິງ GenBank PV202792). ສາມາດເຫັນໄດ້ວ່າ isolate 3 ແມ່ນ isolate ທີ່ຮຸກຮານທີ່ສຸດ; ດັ່ງນັ້ນ, isolate ນີ້ຈຶ່ງຖືກເລືອກເພື່ອການສຶກສາໃນການທົດລອງຕໍ່ມາທັງໝົດ.
ກິດຈະກຳຕ້ານເຊື້ອແບັກທີເຣຍຂອງ diamine L-ornithine (Sigma-Aldrich, Darmstadt, ເຢຍລະມັນ) ໃນຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນທີ່ແຕກຕ່າງກັນ (12.5, 25, 50, 75, 100 ແລະ 125 ມກ/ລິດ) ຕໍ່ກັບ S. sclerotiorum isolate 3 ໄດ້ຖືກສືບສວນໃນຫຼອດທົດລອງ. ເປັນທີ່ໜ້າສັງເກດວ່າ L-ornithine ມີຜົນກະທົບຕໍ່ເຊື້ອແບັກທີເຣຍ ແລະ ຄ່ອຍໆຍັບຍັ້ງການເຕີບໂຕຂອງເຊື້ອ S. sclerotiorum hyphae ໃນລັກສະນະທີ່ຂຶ້ນກັບປະລິມານຢາ (ຮູບທີ 2A, B). ໃນຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນສູງສຸດທີ່ທົດສອບ (125 ມກ/ລິດ), L-ornithine ສະແດງໃຫ້ເຫັນອັດຕາການຍັບຍັ້ງການເຕີບໂຕຂອງເຊື້ອເຫັດສູງສຸດ (99.62 ± 0.27%; ຮູບທີ 2B), ເຊິ່ງທຽບເທົ່າກັບຢາຂ້າເຊື້ອລາ Rizolex-T ທາງການຄ້າ (ອັດຕາການຍັບຍັ້ງ 99.45 ± 0.39%; ຮູບທີ 2C) ໃນຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນສູງສຸດທີ່ທົດສອບ (10 ມກ/ລິດ), ຊີ້ບອກເຖິງປະສິດທິພາບທີ່ຄ້າຍຄືກັນ.
ຮູບທີ 2. ກິດຈະກຳຕ້ານເຊື້ອແບັກທີເຣຍໃນຫຼອດທົດລອງຂອງ L-ornithine ຕໍ່ກັບ Sclerotinia sclerotiorum. (A) ການປຽບທຽບກິດຈະກຳຕ້ານເຊື້ອແບັກທີເຣຍຂອງຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນທີ່ແຕກຕ່າງກັນຂອງ L-ornithine ຕໍ່ກັບ S. sclerotiorum ກັບຢາຂ້າເຊື້ອລາ Rizolex-T ທາງການຄ້າ (10 ມກ/ລ). (B, C) ອັດຕາການຍັບຍັ້ງ (%) ຂອງການເຕີບໂຕຂອງເຊື້ອລາ S. sclerotiorum ຫຼັງຈາກການປິ່ນປົວດ້ວຍຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນທີ່ແຕກຕ່າງກັນຂອງ L-ornithine (12.5, 25, 50, 75, 100 ແລະ 125 ມກ/ລ) ຫຼື Rizolex-T (2, 4, 6, 8 ແລະ 10 ມກ/ລ) ຕາມລຳດັບ. ຄ່າສະແດງເຖິງຄ່າສະເລ່ຍ ± SD ຂອງຫ້າສຳເນົາທາງຊີວະພາບ (n = 5). ຕົວອັກສອນທີ່ແຕກຕ່າງກັນສະແດງເຖິງຄວາມແຕກຕ່າງທາງສະຖິຕິລະຫວ່າງການປິ່ນປົວ (p < 0.05). (D, E) ການວິເຄາະການຖົດຖອຍຂອງຮູບແບບ Probit ຂອງ L-ornithine ແລະຢາຂ້າເຊື້ອລາທາງການຄ້າ Rizolex-T, ຕາມລຳດັບ. ເສັ້ນຖົດຖອຍຂອງຮູບແບບ probit ສະແດງເປັນເສັ້ນສີຟ້າເຂັ້ມ, ແລະຊ່ວງຄວາມເຊື່ອໝັ້ນ (95%) ສະແດງເປັນເສັ້ນສີແດງທີ່ມີເສັ້ນປະ.
ນອກຈາກນັ້ນ, ການວິເຄາະການຖົດຖອຍຂອງ probit ໄດ້ຖືກປະຕິບັດ ແລະຕາຕະລາງທີ່ສອດຄ້ອງກັນໄດ້ສະແດງຢູ່ໃນຕາຕະລາງທີ 1 ແລະຮູບທີ 2D,E. ໂດຍຫຍໍ້, ຄ່າຄວາມຊັນທີ່ຍອມຮັບໄດ້ (y = 2.92x − 4.67) ແລະສະຖິຕິທີ່ສຳຄັນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງ (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 ແລະ p < 0.0001; ຮູບທີ 2D) ຂອງ L-ornithine ຊີ້ບອກເຖິງກິດຈະກຳຕ້ານເຊື້ອລາທີ່ເພີ່ມຂຶ້ນຕໍ່ກັບ S. sclerotiorum ເມື່ອທຽບກັບຢາຂ້າເຊື້ອລາ Rizolex-T ທາງການຄ້າ (y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 ແລະ p < 0.0001) (ຕາຕະລາງທີ 1).
ຕາຕະລາງທີ 1. ຄ່າຂອງຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຍັບຍັ້ງສູງສຸດເຄິ່ງໜຶ່ງ (IC50) ແລະ IC99 (ມກ/ລ) ຂອງ L-ornithine ແລະຢາຂ້າເຊື້ອລາທາງການຄ້າ "Rizolex-T" ຕໍ່ຕ້ານ S. sclerotiorum.
ໂດຍລວມແລ້ວ, L-ornithine (250 ມກ/ລິດ) ໄດ້ຫຼຸດຜ່ອນການພັດທະນາ ແລະ ຄວາມຮຸນແຮງຂອງເຊື້ອລາຂາວໃນຕົ້ນຖົ່ວທົ່ວໄປທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ ເມື່ອທຽບກັບຕົ້ນຖົ່ວທີ່ຕິດເຊື້ອ S. sclerotiorum ທີ່ບໍ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວ (ກຸ່ມຄວບຄຸມ; ຮູບທີ 3A). ໂດຍຫຍໍ້, ເຖິງແມ່ນວ່າຄວາມຮຸນແຮງຂອງພະຍາດຂອງຕົ້ນຖົ່ວຄວບຄຸມທີ່ຕິດເຊື້ອທີ່ບໍ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວຈະເພີ່ມຂຶ້ນເທື່ອລະກ້າວ (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61, ແລະ 92.33 ± 3.06%), L-ornithine ໄດ້ຫຼຸດຜ່ອນຄວາມຮຸນແຮງຂອງພະຍາດຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ (%) ຕະຫຼອດການທົດລອງ (8.97 ± 0.15, 18.00 ± 1.00, ແລະ 26.36 ± 3.07) ໃນເວລາ 7, 14, ແລະ 21 ມື້ຫຼັງການປິ່ນປົວ (dpt), ຕາມລຳດັບ (ຮູບທີ 3A). ໃນລັກສະນະດຽວກັນ, ເມື່ອຕົ້ນຖົ່ວທີ່ຕິດເຊື້ອ S. sclerotiorum ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ L-ornithine 250 ມກ/ລິດ, ພື້ນທີ່ພາຍໃຕ້ເສັ້ນໂຄ້ງຄວາມຄືບໜ້າຂອງພະຍາດ (AUDPC) ຫຼຸດລົງຈາກ 1274.33 ± 33.13 ໃນກຸ່ມຄວບຄຸມທີ່ບໍ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວເປັນ 281.03 ± 7.95, ເຊິ່ງຕໍ່າກວ່າເລັກນ້ອຍເມື່ອທຽບກັບກຸ່ມຄວບຄຸມທີ່ເປັນບວກ 50 ມກ/ລິດ ດ້ວຍຢາຂ້າເຊື້ອລາ Rizolex-T (183.61 ± 7.71; ຮູບທີ 3B). ແນວໂນ້ມດຽວກັນນີ້ໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນໃນການທົດລອງຄັ້ງທີສອງ.
ຮູບທີ 3. ຜົນກະທົບຂອງການໃຊ້ L-ornithine ຈາກພາຍນອກຕໍ່ການເກີດພະຍາດເນົ່າເປື່ອຍຂາວຂອງຖົ່ວເຫຼືອງທີ່ເກີດຈາກ Sclerotinia sclerotiorum ພາຍໃຕ້ສະພາບເຮືອນແກ້ວ. (A) ເສັ້ນໂຄ້ງຄວາມຄືບໜ້າຂອງພະຍາດຂອງເຊື້ອລາຂາວຂອງຖົ່ວເຫຼືອງຫຼັງຈາກການປິ່ນປົວດ້ວຍ L-ornithine 250 ມກ/ລິດ. (B) ພື້ນທີ່ພາຍໃຕ້ເສັ້ນໂຄ້ງຄວາມຄືບໜ້າຂອງພະຍາດ (AUDPC) ຂອງເຊື້ອລາຂາວຂອງຖົ່ວເຫຼືອງຫຼັງຈາກການປິ່ນປົວດ້ວຍ L-ornithine. ຄ່າສະແດງເຖິງຄ່າສະເລ່ຍ ± SD ຂອງຫ້າສຳເນົາທາງຊີວະພາບ (n = 5). ຕົວອັກສອນທີ່ແຕກຕ່າງກັນສະແດງເຖິງຄວາມແຕກຕ່າງທີ່ມີນัยສຳຄັນທາງສະຖິຕິລະຫວ່າງການປິ່ນປົວ (p < 0.05).
ການໃຊ້ L-ornithine ໃນປະລິມານ 250 ມກ/ລິດ ຈາກພາຍນອກຄ່ອຍໆເພີ່ມຄວາມສູງຂອງຕົ້ນໄມ້ (ຮູບທີ 4A), ຈຳນວນກິ່ງງ່າຕໍ່ຕົ້ນໄມ້ (ຮູບທີ 4B), ແລະ ຈຳນວນໃບຕໍ່ຕົ້ນໄມ້ (ຮູບທີ 4C) ຫຼັງຈາກ 42 ມື້. ໃນຂະນະທີ່ຢາຂ້າເຊື້ອຣາ Rizolex-T (50 ມກ/ລິດ) ທາງການຄ້າມີຜົນກະທົບຫຼາຍທີ່ສຸດຕໍ່ຕົວກໍານົດທາງໂພຊະນາການທັງໝົດທີ່ໄດ້ສຶກສາ, ການໃຊ້ L-ornithine ໃນປະລິມານ 250 ມກ/ລິດ ຈາກພາຍນອກມີຜົນກະທົບທີ່ໃຫຍ່ທີ່ສຸດອັນດັບສອງເມື່ອທຽບກັບກຸ່ມຄວບຄຸມທີ່ບໍ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວ (ຮູບທີ 4A–C). ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, ການປິ່ນປົວດ້ວຍ L-ornithine ບໍ່ມີຜົນກະທົບທີ່ສໍາຄັນຕໍ່ປະລິມານຂອງເມັດສີສັງເຄາະແສງ chlorophyll a (ຮູບທີ 4D) ແລະ chlorophyll b (ຮູບທີ 4E), ແຕ່ເພີ່ມປະລິມານ carotenoid ທັງໝົດ (0.56 ± 0.03 ມກ/ກ fr wt) ເລັກນ້ອຍເມື່ອທຽບກັບກຸ່ມຄວບຄຸມທາງລົບ (0.44 ± 0.02 ມກ/ກ fr wt) ແລະ ກຸ່ມຄວບຄຸມທາງບວກ (0.46 ± 0.02 ມກ/ກ fr wt; ຮູບທີ 4F). ໂດຍລວມແລ້ວ, ຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າ L-ornithine ບໍ່ມີສານພິດຕໍ່ພືດຕະກຸນຖົ່ວທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວ ແລະ ອາດຈະກະຕຸ້ນການເຕີບໃຫຍ່ຂອງມັນໄດ້.
ຮູບທີ 4. ຜົນກະທົບຂອງການໃຊ້ L-ornithine ຈາກພາຍນອກຕໍ່ລັກສະນະການຈະເລີນເຕີບໂຕ ແລະ ເມັດສີສັງເຄາະແສງຂອງໃບຖົ່ວທີ່ຕິດເຊື້ອ Sclerotinia sclerotiorum ພາຍໃຕ້ສະພາບເຮືອນແກ້ວ. (A) ຄວາມສູງຂອງຕົ້ນໄມ້ (ຊມ), (B) ຈຳນວນກິ່ງງ່າຕໍ່ຕົ້ນໄມ້, (C) ຈຳນວນໃບຕໍ່ຕົ້ນໄມ້, (D) ປະລິມານ Chlorophyll a (mg g-1 fr wt), (E) ປະລິມານ Chlorophyll b (mg g-1 fr wt), (F) ປະລິມານ carotenoid ທັງໝົດ (mg g-1 fr wt). ຄ່າແມ່ນຄ່າສະເລ່ຍ ± SD ຂອງຫ້າສຳເນົາທາງຊີວະພາບ (n = 5). ຕົວອັກສອນທີ່ແຕກຕ່າງກັນຊີ້ບອກເຖິງຄວາມແຕກຕ່າງທີ່ສຳຄັນທາງສະຖິຕິລະຫວ່າງການປິ່ນປົວ (p < 0.05).
ການລະບຸຕຳແໜ່ງທາງຊີວະເຄມີໃນສະຖານທີ່ຂອງຊະນິດອົກຊີເຈນທີ່ມີປະຕິກິລິຍາ (ROS; ສະແດງເປັນໄຮໂດຣເຈນເປີອອກໄຊ [H2O2]) ແລະອະນຸມູນອິດສະຫຼະ (ສະແດງເປັນອະນຸມູນອິດສະຫຼະ superoxide [O2•−]) ໄດ້ເປີດເຜີຍວ່າການໃຊ້ L-ornithine (250 ມກ/ລິດ) ຈາກພາຍນອກຊ່ວຍຫຼຸດຜ່ອນການສະສົມຂອງ H2O2 (96.05 ± 5.33 nmol.g−1 FW; ຮູບທີ 5A) ແລະ O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; ຮູບທີ 5B) ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍເມື່ອທຽບກັບການສະສົມຂອງທັງພືດທີ່ຕິດເຊື້ອທີ່ບໍ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວ (173.31 ± 12.06 ແລະ 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW, ຕາມລຳດັບ) ແລະພືດທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍຢາຂ້າເຊື້ອຣາ Rizolex-T ໃນປະລິມານ 50 ມກ/ລິດ (170.12 ± 9.50 ແລະ 157.00 ± 7.81 nmol.g−1 fr wt, ຕາມລຳດັບ) ທີ່ 72 ຊົ່ວໂມງ. ລະດັບສູງຂອງ H2O2 ແລະ O2•− ສະສົມພາຍໃຕ້ hpt (ຮູບທີ 5A, B). ໃນທຳນອງດຽວກັນ, ການທົດສອບ malondialdehyde (MDA) ທີ່ອີງໃສ່ TCA ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າຕົ້ນຖົ່ວທີ່ຕິດເຊື້ອ S. sclerotiorum ສະສົມລະດັບ MDA ສູງຂຶ້ນ (113.48 ± 10.02 nmol.g fr wt) ໃນໃບຂອງມັນ (ຮູບທີ 5C). ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ການໃຊ້ L-ornithine ຈາກພາຍນອກຊ່ວຍຫຼຸດຜ່ອນການຜຸພັງຂອງໄຂມັນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ ດັ່ງທີ່ເຫັນໄດ້ຈາກການຫຼຸດລົງຂອງປະລິມານ MDA ໃນຕົ້ນທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວ (33.08 ± 4.00 nmol.g fr wt).
ຮູບທີ 5. ຜົນກະທົບຂອງການໃຊ້ L-ornithine ຈາກພາຍນອກຕໍ່ເຄື່ອງໝາຍຫຼັກຂອງຄວາມກົດດັນຜຸພັງ ແລະ ກົນໄກການປ້ອງກັນສານຕ້ານອະນຸມູນອິດສະລະທີ່ບໍ່ແມ່ນເອນໄຊໃນໃບຖົ່ວທີ່ຕິດເຊື້ອ S. sclerotiorum ໃນເວລາ 72 ຊົ່ວໂມງຫຼັງຈາກການຕິດເຊື້ອພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂເຮືອນແກ້ວ. (A) ໄຮໂດຣເຈນເປີອອກໄຊ (H2O2; nmol g−1 FW) ທີ່ 72 hpt, (B) ແອນອີອອນຊູເປີອອກໄຊ (O2•−; nmol g−1 FW) ທີ່ 72 hpt, (C) ມາລອນດີໄຮເດຣດ (MDA; nmol g−1 FW) ທີ່ 72 hpt, (D) ຟີນອນທີ່ລະລາຍທັງໝົດ (ມກ GAE g−1 FW) ທີ່ 72 hpt, (E) ຟາໂລໄນອອຍທີ່ລະລາຍທັງໝົດ (ມກ RE g−1 FW) ທີ່ 72 hpt, (F) ກົດອະມິໂນອິດສະຫຼະທັງໝົດ (ມກ g−1 FW) ທີ່ 72 hpt, ແລະ (G) ປະລິມານໂປຣລີນ (ມກ g−1 FW) ທີ່ 72 hpt. ຄ່າຕ່າງໆສະແດງເຖິງຄ່າສະເລ່ຍ ± ຄ່າຜັນປ່ຽນມາດຕະຖານ (ຄ່າສະເລ່ຍ ± SD) ຂອງ 5 ສຳເນົາທາງຊີວະວິທະຍາ (n = 5). ຕົວອັກສອນທີ່ແຕກຕ່າງກັນສະແດງເຖິງຄວາມແຕກຕ່າງທີ່ສຳຄັນທາງສະຖິຕິລະຫວ່າງການປິ່ນປົວ (p < 0.05).