ປະຈຸບັນ *ທີ່ຢູ່ປັດຈຸບັນ: Cologne 50931, ເຢຍລະມັນ, Cologne Excellence Cluster Research on Cellular Stress Response in Aging-related Diseases (CECAD).
ການເສື່ອມສະພາບຂອງລະບົບປະສາດຂອງພະຍາດໄມໂທຄອນເດຣຍຖືວ່າເປັນສິ່ງທີ່ບໍ່ສາມາດແກ້ໄຂໄດ້ເນື່ອງຈາກຄວາມຍືດຫຍຸ່ນທາງເມຕາບໍລິກຂອງເຊວປະສາດມີຈຳກັດ, ແຕ່ຜົນກະທົບຂອງຄວາມຜິດປົກກະຕິຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍຕໍ່ຄວາມເປັນເອກະລາດຂອງເຊວຂອງການເຜົາຜານຂອງເຊວປະສາດໃນຮ່າງກາຍແມ່ນຍັງເຂົ້າໃຈຍາກ. ໃນທີ່ນີ້, ພວກເຮົາແນະນຳໂປຣຕີໂອມສະເພາະເຊວຂອງເຊວປະສາດ Purkinje ທີ່ມີການຂາດ OXPHOS ທີ່ກ້າວໜ້າທີ່ເກີດຈາກການເຄື່ອນໄຫວຂອງການລວມຕົວຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍທີ່ຖືກລົບກວນ. ພວກເຮົາພົບວ່າຄວາມຜິດປົກກະຕິຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍໄດ້ກະຕຸ້ນການປ່ຽນແປງຢ່າງເລິກເຊິ່ງໃນຂົງເຂດໂປຣຕີໂອມິກ, ເຊິ່ງໃນທີ່ສຸດໄດ້ນຳໄປສູ່ການກະຕຸ້ນຕາມລຳດັບຂອງໂຄງການການເຜົາຜານທີ່ແນ່ນອນກ່ອນການຕາຍຂອງເຊວ. ໂດຍບໍ່ຄາດຄິດ, ພວກເຮົາໄດ້ກຳນົດການກະຕຸ້ນທີ່ຊັດເຈນຂອງ pyruvate carboxylase (PCx) ແລະເອນໄຊຕ້ານການແກ່ຕົວອື່ນໆທີ່ເສີມຕົວກາງຂອງວົງຈອນ TCA. ການຍັບຍັ້ງ PCx ເຮັດໃຫ້ຄວາມກົດດັນທາງອົກຊີເດຊັນ ແລະ ການເສື່ອມສະພາບຂອງເຊວປະສາດຮ້າຍແຮງຂຶ້ນ, ຊີ້ບອກວ່າພະຍາດເສັ້ນເລືອດແຂງມີຜົນປ້ອງກັນໃນເຊວປະສາດທີ່ຂາດ OXPHOS. ການຟື້ນຟູການລວມຕົວຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍໃນເຊວປະສາດທີ່ເສື່ອມສະພາບສຸດທ້າຍຈະປ່ຽນແປງລັກສະນະການເຜົາຜານເຫຼົ່ານີ້ຢ່າງສິ້ນເຊີງ, ດັ່ງນັ້ນຈຶ່ງປ້ອງກັນການຕາຍຂອງເຊວ. ການຄົ້ນພົບຂອງພວກເຮົາລະບຸເສັ້ນທາງທີ່ບໍ່ຮູ້ຈັກມາກ່ອນທີ່ໃຫ້ຄວາມຢືດຢຸ່ນຕໍ່ກັບຄວາມຜິດປົກກະຕິຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍ ແລະສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າການເສື່ອມສະພາບຂອງເຊວປະສາດສາມາດປ່ຽນແປງໄດ້ເຖິງແມ່ນວ່າໃນໄລຍະທ້າຍຂອງພະຍາດ.
ບົດບາດຫຼັກຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍໃນການຮັກສາການເຜົາຜານພະລັງງານຂອງເຊວປະສາດແມ່ນເນັ້ນໜັກໂດຍອາການທາງລະບົບປະສາດຢ່າງກວ້າງຂວາງທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບພະຍາດໄມໂທຄອນເດຣຍຂອງມະນຸດ. ພະຍາດເຫຼົ່ານີ້ສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນເກີດຈາກການກາຍພັນຂອງ gene ທີ່ຄວບຄຸມການສະແດງອອກຂອງ gene ໄມໂທຄອນເດຣຍ (1, 2) ຫຼື ການທຳລາຍ gene ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບການເຄື່ອນໄຫວຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍ, ເຊິ່ງສົ່ງຜົນກະທົບທາງອ້ອມຕໍ່ຄວາມໝັ້ນຄົງຂອງ DNA ໄມໂທຄອນເດຣຍ (mtDNA) (3, 4). ວຽກງານໃນຮູບແບບສັດໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າໃນການຕອບສະໜອງຕໍ່ຄວາມຜິດປົກກະຕິຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍໃນເນື້ອເຍື່ອອ້ອມຂ້າງ, ເສັ້ນທາງການເຜົາຜານອາຫານທີ່ອະນຸລັກ (5-7) ສາມາດກະຕຸ້ນໄດ້, ເຊິ່ງໃຫ້ຂໍ້ມູນທີ່ສຳຄັນສຳລັບຄວາມເຂົ້າໃຈຢ່າງເລິກເຊິ່ງກ່ຽວກັບການເກີດພະຍາດຂອງພະຍາດທີ່ສັບສົນເຫຼົ່ານີ້. ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, ຄວາມເຂົ້າໃຈຂອງພວກເຮົາກ່ຽວກັບການປ່ຽນແປງການເຜົາຜານອາຫານຂອງເຊວສະເພາະທີ່ເກີດຈາກຄວາມລົ້ມເຫຼວທົ່ວໄປຂອງການຜະລິດ adenosine triphosphate (ATP) ຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍໃນສະໝອງແມ່ນພື້ນຖານ (8), ໂດຍເນັ້ນໜັກເຖິງຄວາມຕ້ອງການທີ່ຈະກຳນົດເປົ້າໝາຍການປິ່ນປົວທີ່ສາມາດນຳໃຊ້ເພື່ອປ້ອງກັນ ຫຼື ປ້ອງກັນພະຍາດ. ປ້ອງກັນການເສື່ອມສະພາບຂອງລະບົບປະສາດ (9). ການຂາດຂໍ້ມູນແມ່ນຄວາມຈິງທີ່ວ່າເຊວປະສາດຖືກພິຈາລະນາຢ່າງກວ້າງຂວາງວ່າມີຄວາມຍືດຫຍຸ່ນໃນການເຜົາຜານອາຫານທີ່ຈຳກັດຫຼາຍເມື່ອທຽບກັບປະເພດເຊວຂອງເນື້ອເຍື່ອອ້ອມຂ້າງ (10). ເນື່ອງຈາກວ່າຈຸລັງເຫຼົ່ານີ້ມີບົດບາດສຳຄັນໃນການປະສານງານການສະໜອງສານເມຕາໂບໄລທ໌ໃຫ້ກັບເຊວປະສາດເພື່ອສົ່ງເສີມການສົ່ງສັນຍານ synaptic ແລະຕອບສະໜອງຕໍ່ການບາດເຈັບ ແລະ ພະຍາດ, ຄວາມສາມາດໃນການປັບຕົວການເຜົາຜານອາຫານຂອງເຊວໃຫ້ເຂົ້າກັບສະພາບທີ່ທ້າທາຍຂອງເນື້ອເຍື່ອສະໝອງແມ່ນເກືອບຈຳກັດຢູ່ໃນຈຸລັງ glial (11-14). ນອກຈາກນັ້ນ, ຄວາມແຕກຕ່າງຂອງເຊວໂດຍທຳມະຊາດຂອງເນື້ອເຍື່ອສະໝອງສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນເປັນອຸປະສັກຕໍ່ການສຶກສາກ່ຽວກັບການປ່ຽນແປງການເຜົາຜານອາຫານທີ່ເກີດຂຶ້ນໃນກຸ່ມຍ່ອຍຂອງເຊວປະສາດສະເພາະ. ດັ່ງນັ້ນ, ມີຄວາມຮູ້ໜ້ອຍກ່ຽວກັບຜົນສະທ້ອນຂອງເຊວ ແລະ ການເຜົາຜານອາຫານທີ່ແນ່ນອນຂອງການເຮັດວຽກຜິດປົກກະຕິຂອງ mitochondrial ໃນເຊວປະສາດ.
ເພື່ອເຂົ້າໃຈຜົນສະທ້ອນດ້ານການເຜົາຜານອາຫານຂອງການເຮັດວຽກຜິດປົກກະຕິຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍ, ພວກເຮົາໄດ້ແຍກເຊວປະສາດ Purkinje (PNs) ໃນໄລຍະຕ່າງໆຂອງການເສື່ອມສະພາບຂອງລະບົບປະສາດທີ່ເກີດຈາກການທຳລາຍການລວມຕົວຂອງເຍື່ອຫຸ້ມເຊວນອກໄມໂທຄອນເດຣຍ (Mfn2). ເຖິງແມ່ນວ່າການກາຍພັນຂອງ Mfn2 ໃນມະນຸດແມ່ນກ່ຽວຂ້ອງກັບຮູບແບບຂອງພະຍາດທາງປະສາດຮັບຮູ້ມໍເຕີທີ່ສືບທອດມາເຊິ່ງເປັນທີ່ຮູ້ຈັກກັນໃນນາມ Charcot-Marie-Tooth ປະເພດ 2A (15), ການທຳລາຍ Mfn2 ແບບມີເງື່ອນໄຂໃນໜູແມ່ນການກະຕຸ້ນທີ່ໄດ້ຮັບການຍອມຮັບຢ່າງດີຂອງວິທີການເຮັດວຽກຜິດປົກກະຕິຂອງອົກຊີເດຊັນ Phosphorylation (OXPHOS). ຊະນິດຍ່ອຍຂອງເຊວປະສາດຕ່າງໆ (16-19) ແລະຮູບແບບການເສື່ອມສະພາບຂອງລະບົບປະສາດທີ່ເກີດຂຶ້ນແມ່ນມາພ້ອມກັບອາການທາງລະບົບປະສາດທີ່ກ້າວໜ້າ, ເຊັ່ນ: ຄວາມຜິດປົກກະຕິຂອງການເຄື່ອນໄຫວ (18, 19) ຫຼື cerebellum ataxia (16). ໂດຍການນໍາໃຊ້ການປະສົມປະສານຂອງວິທີການວິເຄາະປະລິມານ (LFQ), ການວິເຄາະທາງເມຕາໂບໂລມິກ, ການຖ່າຍພາບ, ແລະ ວິທີການໄວຣັສວິທະຍາທີ່ບໍ່ມີປ້າຍຊື່, ພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າການເສື່ອມສະພາບຂອງລະບົບປະສາດທີ່ກ້າວໜ້າກະຕຸ້ນໃຫ້ເກີດ pyruvate carboxylase (PCx) ແລະ ປັດໄຈອື່ນໆທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບການເສື່ອມສະພາບຂອງ PNs ໃນຮ່າງກາຍ. ເພື່ອກວດສອບຄວາມກ່ຽວຂ້ອງຂອງການຄົ້ນພົບນີ້, ພວກເຮົາໄດ້ຫຼຸດຜ່ອນການສະແດງອອກຂອງ PCx ໃນ PNs ທີ່ຂາດ Mfn2, ແລະ ພົບວ່າການດໍາເນີນງານນີ້ເຮັດໃຫ້ຄວາມກົດດັນທາງອົກຊີເດຊັນຮ້າຍແຮງຂຶ້ນ ແລະ ເລັ່ງການເສື່ອມສະພາບຂອງລະບົບປະສາດ, ດັ່ງນັ້ນຈຶ່ງພິສູດວ່າ azoospermia ເຮັດໃຫ້ເຊວມີການຕາຍ. ການປັບຕົວທາງເມຕາໂບລິກ. ການສະແດງອອກຢ່າງຮຸນແຮງຂອງ MFN2 ສາມາດຊ່ວຍ PN ທີ່ເສື່ອມສະພາບສຸດທ້າຍໄດ້ຢ່າງສົມບູນດ້ວຍການຂາດ OXPHOS ຮ້າຍແຮງ, ການບໍລິໂພກ DNA ຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ, ແລະ ເຄືອຂ່າຍໄມໂທຄອນເດຣຍທີ່ແຕກຫັກ, ເຊິ່ງເນັ້ນໜັກຕື່ມອີກວ່າຮູບແບບການເສື່ອມສະພາບຂອງລະບົບປະສາດນີ້ສາມາດຟື້ນຕົວໄດ້ໃນໄລຍະກ້າວຫນ້າຂອງພະຍາດກ່ອນການຕາຍຂອງເຊວ.
ເພື່ອໃຫ້ເຫັນພາບຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍໃນ PNs Mfn2 knockout, ພວກເຮົາໄດ້ໃຊ້ໜູທີ່ຊ່ວຍໃຫ້ໄມໂທຄອນເດຣຍທີ່ຂຶ້ນກັບ Cre ສາມາດເປົ້າໝາຍການສະແດງອອກຂອງໂປຣຕີນ fluorescent ສີເຫຼືອງ (YFP) (mtYFP) (20) Cre ແລະກວດສອບຮູບຮ່າງຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍໃນຮ່າງກາຍ. ພວກເຮົາພົບວ່າການທຳລາຍຂອງ gene Mfn2 ໃນ PNs ຈະນຳໄປສູ່ການແບ່ງຕົວຂອງເຄືອຂ່າຍໄມໂທຄອນເດຣຍເທື່ອລະກ້າວ (ຮູບ S1A), ແລະການປ່ຽນແປງທີ່ໄວທີ່ສຸດແມ່ນພົບເຫັນຢູ່ໃນອາຍຸ 3 ອາທິດ. ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, ການເສື່ອມສະພາບທີ່ສຳຄັນຂອງຊັ້ນເຊວ PN, ດັ່ງທີ່ເຫັນໄດ້ຈາກການສູນເສຍຂອງ Calbindin immunostaining, ບໍ່ໄດ້ເລີ່ມຕົ້ນຈົນກ່ວາມີອາຍຸ 12 ອາທິດ (ຮູບທີ 1, A ແລະ B). ຄວາມບໍ່ກົງກັນຂອງເວລາລະຫວ່າງການປ່ຽນແປງທີ່ໄວທີ່ສຸດໃນຮູບຮ່າງຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍ ແລະການເລີ່ມຕົ້ນທີ່ເຫັນໄດ້ຂອງການຕາຍຂອງເຊວປະສາດໄດ້ກະຕຸ້ນໃຫ້ພວກເຮົາສືບສວນການປ່ຽນແປງທາງເມຕາໂບລິເຄຊັນທີ່ເກີດຈາກການເຮັດວຽກຜິດປົກກະຕິຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍກ່ອນການຕາຍຂອງເຊວ. ພວກເຮົາໄດ້ພັດທະນາຍຸດທະສາດການຈັດຮຽງຈຸລັງທີ່ກະຕຸ້ນດ້ວຍແສງໄຟ (FACS) ເພື່ອແຍກ PN ທີ່ສະແດງອອກ YFP (YFP+) (ຮູບທີ 1C), ແລະໃນໜູຄວບຄຸມ (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), ຕໍ່ໄປນີ້ຈະເອີ້ນວ່າ CTRL (ຮູບ S1B). ການເພີ່ມປະສິດທິພາບຂອງຍຸດທະສາດ gating ໂດຍອີງໃສ່ຄວາມເຂັ້ມທີ່ກ່ຽວຂ້ອງຂອງສັນຍານ YFP ຊ່ວຍໃຫ້ພວກເຮົາສາມາດບໍລິສຸດຮ່າງກາຍ YFP+ (YFPhigh) ຂອງ PNs ຈາກສ່ວນທີ່ບໍ່ແມ່ນ PNs (YFPneg) (ຮູບ S1B) ຫຼືຊິ້ນສ່ວນ fluorescent axon/dendritic (YFPlow; ຮູບ S1D, ຊ້າຍ), ຢືນຢັນໂດຍກ້ອງຈຸລະທັດ confocal (ຮູບ S1D, ຂວາ). ເພື່ອກວດສອບຕົວຕົນຂອງປະຊາກອນທີ່ຈັດປະເພດ, ພວກເຮົາໄດ້ດຳເນີນການວິເຄາະໂປຣຕີໂອມິກ LFQ ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນວິເຄາະອົງປະກອບຫຼັກ, ແລະພົບວ່າມີການແຍກກັນຢ່າງຈະແຈ້ງລະຫວ່າງຈຸລັງ YFPhigh ແລະ YFPneg (ຮູບ S1C). ຈຸລັງ YFPhigh ສະແດງໃຫ້ເຫັນການເສີມສ້າງສຸດທິຂອງເຄື່ອງໝາຍ PNs ທີ່ຮູ້ຈັກ (ເຊັ່ນ Calb1, Pcp2, Grid2 ແລະ Itpr3) (21, 22), ແຕ່ບໍ່ມີການເສີມສ້າງໂປຣຕີນທີ່ສະແດງອອກທົ່ວໄປໃນເຊວປະສາດ ຫຼື ເຊວປະເພດອື່ນໆ (ຮູບທີ 1D). ການປຽບທຽບລະຫວ່າງຕົວຢ່າງໃນຈຸລັງ YFPhigh ທີ່ຈັດປະເພດທີ່ເກັບກຳໃນການທົດລອງເອກະລາດສະແດງໃຫ້ເຫັນສຳປະສິດສະຫະສຳພັນ > 0.9, ສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງຄວາມສາມາດໃນການສືບພັນທີ່ດີລະຫວ່າງການຊ້ຳຊ້ອນທາງຊີວະພາບ (ຮູບ S1E). ໂດຍສະຫຼຸບແລ້ວ, ຂໍ້ມູນເຫຼົ່ານີ້ໄດ້ຢືນຢັນແຜນການຂອງພວກເຮົາສຳລັບການແຍກ PN ທີ່ເປັນໄປໄດ້ແບບສ້ວຍແຫຼມ ແລະ ສະເພາະ. ເນື່ອງຈາກລະບົບໄດຣເວີ L7-cre ທີ່ໃຊ້ກະຕຸ້ນການລວມຕົວແບບ mosaic ໃນອາທິດທຳອິດຫຼັງຈາກການເກີດລູກ (23), ພວກເຮົາເລີ່ມກຳຈັດໜູຈາກ CTRL ແລະ ເຊວປະສາດເກັບກຳແບບມີເງື່ອນໄຂ (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre). ຫຼັງຈາກການລວມຕົວສຳເລັດແລ້ວ, ມັນຖືກເອີ້ນວ່າ Mfn2cKO ເມື່ອອາຍຸ 4 ອາທິດ. ໃນຖານະເປັນຈຸດສິ້ນສຸດ, ພວກເຮົາໄດ້ເລືອກອາຍຸ 8 ອາທິດ ເມື່ອຊັ້ນ PN ຍັງຄົບຖ້ວນ ເຖິງວ່າຈະມີການແຕກແຍກຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍຢ່າງຈະແຈ້ງ (ຮູບທີ 1B ແລະຮູບ S1A). ໂດຍລວມແລ້ວ, ພວກເຮົາໄດ້ວັດແທກປະລິມານໂປຣຕີນທັງໝົດ 3013 ຊະນິດ, ເຊິ່ງປະມານ 22% ແມ່ນອີງໃສ່ຄຳອະທິບາຍ MitoCarta 2.0 ໂດຍອີງໃສ່ໂປຣຕີໂອມໄມໂທຄອນເດຣຍເປັນໄມໂທຄອນເດຣຍ (ຮູບທີ 1E) (ຮູບທີ 1E) (24). ການວິເຄາະການສະແດງອອກຂອງ gene ທີ່ແຕກຕ່າງກັນທີ່ດຳເນີນໃນອາທິດທີ 8 ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າມີພຽງແຕ່ 10.5% ຂອງໂປຣຕີນທັງໝົດທີ່ມີການປ່ຽນແປງທີ່ສຳຄັນ (ຮູບທີ 1F ແລະຮູບ S1F), ເຊິ່ງໂປຣຕີນ 195 ຊະນິດຖືກຫຼຸດລົງ ແລະ ໂປຣຕີນ 120 ຊະນິດຖືກເພີ່ມຂຶ້ນ (ຮູບທີ 1F). ມັນເປັນສິ່ງທີ່ໜ້າສັງເກດວ່າ "ການວິເຄາະເສັ້ນທາງທີ່ມີນະວັດຕະກໍາ" ຂອງຊຸດຂໍ້ມູນນີ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ gene ທີ່ສະແດງອອກແຕກຕ່າງກັນສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນຢູ່ໃນຊຸດເສັ້ນທາງການເຜົາຜານອາຫານສະເພາະທີ່ຈຳກັດ (ຮູບທີ 1G). ສິ່ງທີ່ໜ້າສົນໃຈແມ່ນ, ເຖິງແມ່ນວ່າການຫຼຸດລົງຂອງເສັ້ນທາງທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ OXPHOS ແລະ ການສົ່ງສັນຍານດ້ວຍແຄວຊຽມຢືນຢັນການກະຕຸ້ນຂອງການເຮັດວຽກຜິດປົກກະຕິຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍໃນ PNs ທີ່ຂາດການລວມຕົວ, ແຕ່ໝວດໝູ່ອື່ນໆທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບການເຜົາຜານອາຊິດອະມິໂນສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນເພີ່ມຂຶ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ, ເຊິ່ງສອດຄ່ອງກັບການເຜົາຜານທີ່ເກີດຂຶ້ນໃນ PNs ຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍ. ການເຊື່ອມຕໍ່ຄືນແມ່ນສອດຄ່ອງ. ຄວາມຜິດປົກກະຕິ.
(A) ຮູບຖ່າຍ confocal ທີ່ເປັນຕົວແທນຂອງພາກສ່ວນ cerebellar ຂອງໜູ CTRL ແລະ Mfn2cKO ສະແດງໃຫ້ເຫັນການສູນເສຍ PNs ຄ່ອຍໆເພີ່ມຂຶ້ນ (calbindin, ສີເທົາ); ນິວເຄຼຍໄດ້ຖືກຕ້ານກັບ DAPI. (B) ການວັດແທກປະລິມານຂອງ (A) (ການວິເຄາະຄວາມແปรປ່ວນທາງດຽວ, ***P<0.001; n = 4 ຫາ 6 ວົງມົນຈາກໜູສາມໂຕ). (C) ຂັ້ນຕອນການເຮັດວຽກທົດລອງ. (D) ການແຈກຢາຍແຜນທີ່ຄວາມຮ້ອນຂອງເຄື່ອງໝາຍສະເພາະກັບ Purkinje (ເທິງ) ແລະປະເພດຈຸລັງອື່ນໆ (ກາງ). (E) ແຜນວາດ Venn ສະແດງຈຳນວນໂປຣຕີນ mitochondrial ທີ່ລະບຸໃນ PN ທີ່ຈັດປະເພດ. (F) ແຜນຜັງພູເຂົາໄຟຂອງໂປຣຕີນທີ່ສະແດງອອກແຕກຕ່າງກັນໃນ neurons Mfn2cKO ໃນເວລາ 8 ອາທິດ (ຄ່າຕັດຄວາມສຳຄັນ 1.3). (G) ການວິເຄາະເສັ້ນທາງຄວາມຄິດສ້າງສັນສະແດງໃຫ້ເຫັນເສັ້ນທາງ up-regulation (ສີແດງ) ແລະ down-regulation (ສີຟ້າ) ທີ່ສຳຄັນທີ່ສຸດຫ້າເສັ້ນທາງໃນ Mfn2cKO PN ທີ່ຈັດປະເພດເປັນ 8 ອາທິດ. ລະດັບການສະແດງອອກສະເລ່ຍຂອງໂປຣຕີນທີ່ກວດພົບແຕ່ລະອັນແມ່ນສະແດງ. ແຜນທີ່ຄວາມຮ້ອນສີເທົາ: ຄ່າ P ທີ່ປັບແລ້ວ. ns, ບໍ່ສຳຄັນ.
ຂໍ້ມູນໂປຣຕີໂອມິກສ໌ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າການສະແດງອອກຂອງໂປຣຕີນຂອງສະລັບສັບຊ້ອນ I, III, ແລະ IV ຄ່ອຍໆຫຼຸດລົງ. ສະລັບສັບຊ້ອນ I, III, ແລະ IV ທັງໝົດປະກອບດ້ວຍຫົວໜ່ວຍຍ່ອຍທີ່ເຂົ້າລະຫັດ mtDNA ທີ່ສຳຄັນ, ໃນຂະນະທີ່ສະລັບສັບຊ້ອນ II, ເຊິ່ງເປັນພຽງແຕ່ລະຫັດນິວເຄຼຍ, ໂດຍພື້ນຖານແລ້ວບໍ່ໄດ້ຮັບຜົນກະທົບ (ຮູບທີ 2A ແລະຮູບທີ S2A). . ສອດຄ່ອງກັບຜົນໄດ້ຮັບຂອງໂປຣຕີໂອມິກສ໌, immunohistochemistry ຂອງພາກສ່ວນເນື້ອເຍື່ອ cerebellar ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າລະດັບຫົວໜ່ວຍຍ່ອຍ MTCO1 (ໜ່ວຍຍ່ອຍ mitochondrial cytochrome C oxidase 1) ຂອງສະລັບສັບຊ້ອນ IV ໃນ PN ຄ່ອຍໆຫຼຸດລົງ (ຮູບທີ 2B). ໜ່ວຍຍ່ອຍທີ່ເຂົ້າລະຫັດ mtDNA Mtatp8 ໄດ້ຫຼຸດລົງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ (ຮູບທີ S2A), ໃນຂະນະທີ່ລະດັບສະຖານະຄົງທີ່ຂອງຫົວໜ່ວຍຍ່ອຍ ATP synthase ທີ່ຖືກເຂົ້າລະຫັດນິວເຄຼຍຍັງຄົງບໍ່ປ່ຽນແປງ, ເຊິ່ງສອດຄ່ອງກັບສະລັບສັບຊ້ອນ F1 ຂອງຊຸດຍ່ອຍ ATP synthase ທີ່ໝັ້ນຄົງທີ່ຮູ້ຈັກເມື່ອການສະແດງອອກ mtDNA ໝັ້ນຄົງ. ການສ້າງແມ່ນສອດຄ່ອງ. ຂັດຂວາງ (7). ການປະເມີນລະດັບ mtDNA ໃນ Mfn2cKO PNs ທີ່ຖືກຄັດແຍກໂດຍປະຕິກິລິຍາລະບົບຕ່ອງໂສ້ໂພລີເມີເຣສແບບເວລາຈິງ (qPCR) ໄດ້ຢືນຢັນການຫຼຸດລົງເທື່ອລະກ້າວຂອງຈຳນວນສຳເນົາ mtDNA. ເມື່ອປຽບທຽບກັບກຸ່ມຄວບຄຸມ, ໃນເວລາອາຍຸ 8 ອາທິດ, ມີພຽງປະມານ 20% ຂອງລະດັບ mtDNA ເທົ່ານັ້ນທີ່ຍັງຄົງຢູ່ (ຮູບທີ 2C). ສອດຄ່ອງກັບຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້, ການຍ້ອມສີດ້ວຍກ້ອງຈຸລະທັດ confocal ຂອງ Mfn2cKO PNs ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອກວດຫາ DNA, ສະແດງໃຫ້ເຫັນການບໍລິໂພກນິວຄລີໂອໄທຣຽມທີ່ຂຶ້ນກັບເວລາ (ຮູບທີ 2D). ພວກເຮົາພົບວ່າມີພຽງບາງຕົວເລືອກທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບການເສື່ອມສະພາບຂອງໂປຣຕີນໄມໂທຄອນເດຣຍ ແລະ ການຕອບສະໜອງຕໍ່ຄວາມຕຶງຄຽດເທົ່ານັ້ນທີ່ເພີ່ມຂຶ້ນ, ລວມທັງ Lonp1, Afg3l2 ແລະ Clpx, ແລະ OXPHOS complex assembly factors. ບໍ່ມີການປ່ຽນແປງທີ່ສຳຄັນໃນລະດັບຂອງໂປຣຕີນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ apoptosis ທີ່ກວດພົບ (ຮູບ S2B). ເຊັ່ນດຽວກັນ, ພວກເຮົາພົບວ່າ mitochondria ແລະ ຊ່ອງທາງ reticulum endoplasmic ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບການຂົນສົ່ງແຄວຊຽມມີການປ່ຽນແປງເລັກນ້ອຍເທົ່ານັ້ນ (ຮູບ S2C). ນອກຈາກນັ້ນ, ການປະເມີນໂປຣຕີນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ autophagy ບໍ່ພົບການປ່ຽນແປງທີ່ສຳຄັນ, ເຊິ່ງສອດຄ່ອງກັບການກະຕຸ້ນທີ່ເຫັນໄດ້ຂອງ autophagosomes ທີ່ສັງເກດເຫັນໃນຮ່າງກາຍໂດຍ immunohistochemistry ແລະກ້ອງຈຸລະທັດເອເລັກຕຣອນ (ຮູບ S3). ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ຄວາມຜິດປົກກະຕິຂອງ OXPHOS ທີ່ກ້າວໜ້າໃນ PNs ແມ່ນມາພ້ອມກັບການປ່ຽນແປງຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍທີ່ເຫັນໄດ້ຊັດເຈນ. ກຸ່ມໄມໂທຄອນເດຣຍສາມາດເຫັນໄດ້ໃນຈຸລັງ ແລະຕົ້ນໄມ້ dendritic ຂອງ Mfn2cKO PNs ທີ່ມີອາຍຸ 5 ແລະ 8 ອາທິດ, ແລະໂຄງສ້າງເຍື່ອຫຸ້ມພາຍໃນໄດ້ຜ່ານການປ່ຽນແປງຢ່າງເລິກເຊິ່ງ (ຮູບ S4, A ແລະ B). ສອດຄ່ອງກັບການປ່ຽນແປງທີ່ສຳຄັນເຫຼົ່ານີ້ ແລະການຫຼຸດລົງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນ mtDNA, ການວິເຄາະຊິ້ນສ່ວນ cerebellar cerebral ສ້ວຍແຫຼມດ້ວຍ tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າທ່າແຮງຂອງເຍື່ອຫຸ້ມໄມໂທຄອນເດຣຍໃນ Mfn2cKO PNs ໄດ້ຫຼຸດລົງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ (ຮູບ S4C).
(A) ການວິເຄາະໄລຍະເວລາຂອງລະດັບການສະແດງອອກຂອງສະລັບສັບຊ້ອນ OXPHOS. ພິຈາລະນາພຽງແຕ່ໂປຣຕີນທີ່ມີ P<0.05 ທີ່ 8 ອາທິດ (ANOVA ສອງທາງ). ເສັ້ນປະ: ບໍ່ມີການປັບຕົວເມື່ອທຽບກັບ CTRL. (B) ຊ້າຍ: ຕົວຢ່າງຂອງພາກສ່ວນ cerebellar ທີ່ມີປ້າຍກຳກັບດ້ວຍພູມຕ້ານທານຕ້ານ MTCO1 (ແຖບຂະໜາດ, 20 μm). ພື້ນທີ່ທີ່ຄອບຄອງໂດຍຈຸລັງ Purkinje ຖືກປົກຄຸມດ້ວຍສີເຫຼືອງ. ຂວາ: ການວັດແທກປະລິມານຂອງລະດັບ MTCO1 (ການວິເຄາະຄວາມແปรປ່ວນທາງດຽວ; n = 7 ຫາ 20 ຈຸລັງທີ່ວິເຄາະຈາກໜູສາມໂຕ). (C) ການວິເຄາະ qPCR ຂອງຈຳນວນສຳເນົາ mtDNA ໃນ PN ທີ່ຈັດຮຽງ (ການວິເຄາະຄວາມແปรປ່ວນທາງດຽວ; n = 3 ຫາ 7 ຈຸລັງ). (D) ຊ້າຍ: ຕົວຢ່າງຂອງຊິ້ນສ່ວນ cerebellar ທີ່ມີປ້າຍກຳກັບດ້ວຍພູມຕ້ານທານຕ້ານ DNA (ແຖບຂະໜາດ, 20 μm). ພື້ນທີ່ທີ່ຄອບຄອງໂດຍຈຸລັງ Purkinje ຖືກປົກຄຸມດ້ວຍສີເຫຼືອງ. ຂວາ: ການວັດແທກປະລິມານຂອງບາດແຜ mtDNA (ການວິເຄາະຄວາມແปรປ່ວນທາງດຽວ; n = 5 ຫາ 9 ຈຸລັງຈາກໜູສາມໂຕ). (E) ຕົວຢ່າງຂອງພາກສ່ວນ cerebellar ສ້ວຍແຫຼມທີ່ສະແດງໃຫ້ເຫັນຈຸລັງ mitoYFP + Purkinje (ລູກສອນ) ໃນການບັນທຶກການຍຶດ patch clamp ຂອງຈຸລັງທັງໝົດ. (F) ການວັດແທກປະລິມານຂອງເສັ້ນໂຄ້ງ IV. (G) ການບັນທຶກຕົວແທນຂອງການສີດກະແສໄຟຟ້າ depolarizing ໃນຈຸລັງ CTRL ແລະ Mfn2cKO Purkinje. ຮ່ອງຮອຍດ້ານເທິງ: ກຳມະຈອນທຳອິດທີ່ກະຕຸ້ນ AP. ຮ່ອງຮອຍດ້ານລຸ່ມ: ຄວາມຖີ່ AP ສູງສຸດ. (H) ການວັດແທກປະລິມານຂອງການປ້ອນຂໍ້ມູນ spontaneous postsynaptic (sPSPs). ຮ່ອງຮອຍການບັນທຶກຕົວແທນ ແລະ ອັດຕາການຊູມຂອງມັນແມ່ນສະແດງຢູ່ໃນ (I). ການວິເຄາະຄວາມແปรປ່ວນທາງດຽວໄດ້ວິເຄາະ n = 5 ຫາ 20 ຈຸລັງຈາກໜູສາມໂຕ. ຂໍ້ມູນຖືກສະແດງເປັນຄ່າສະເລ່ຍ ± SEM; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) ຮ່ອງຮອຍຕົວແທນຂອງ spontaneous AP ທີ່ບັນທຶກໄວ້ໂດຍໃຊ້ໂໝດຍຶດ patch clamp ແບບເຈາະຮູ. ຮ່ອງຮອຍດ້ານເທິງ: ຄວາມຖີ່ AP ສູງສຸດ. ຮ່ອງຮອຍດ້ານລຸ່ມ: ການຊູມຂອງ AP ດຽວ. (K) ການວັດແທກຄວາມຖີ່ AP ສະເລ່ຍ ແລະ ສູງສຸດຕາມ (J). ການທົດສອບ Mann-Whitney; n = 5 ຈຸລັງໄດ້ຖືກວິເຄາະຈາກໜູສີ່ໂຕ. ຂໍ້ມູນຖືກສະແດງເປັນຄ່າສະເລ່ຍ ± SEM; ບໍ່ສຳຄັນ.
ຄວາມເສຍຫາຍຂອງ OXPHOS ຢ່າງຈະແຈ້ງໄດ້ຖືກກວດພົບໃນ PN Mfn2cKO ອາຍຸ 8 ອາທິດ, ຊີ້ບອກວ່າໜ້າທີ່ທາງສະລີລະວິທະຍາຂອງເຊວປະສາດແມ່ນຜິດປົກກະຕິຢ່າງຮ້າຍແຮງ. ດັ່ງນັ້ນ, ພວກເຮົາໄດ້ວິເຄາະລັກສະນະທາງໄຟຟ້າແບບ passive ຂອງເຊວປະສາດທີ່ຂາດ OXPHOS ໃນເວລາ 4 ຫາ 5 ອາທິດ ແລະ 7 ຫາ 8 ອາທິດ ໂດຍການບັນທຶກການຍຶດເກາະຈຸລັງທັງໝົດໃນຊິ້ນສ່ວນຂອງ cerebellum ສ້ວຍແຫຼມ (ຮູບທີ 2E). ໂດຍບໍ່ຄາດຄິດ, ທ່າແຮງຂອງເຍື່ອຫຸ້ມສະໝອງພັກຜ່ອນສະເລ່ຍ ແລະ ຄວາມຕ້ານທານການປ້ອນຂໍ້ມູນຂອງເຊວປະສາດ Mfn2cKO ແມ່ນຄ້າຍຄືກັນກັບກຸ່ມຄວບຄຸມ, ເຖິງແມ່ນວ່າຈະມີຄວາມແຕກຕ່າງເລັກນ້ອຍລະຫວ່າງເຊວ (ຕາຕະລາງທີ 1). ເຊັ່ນດຽວກັນ, ໃນເວລາອາຍຸ 4 ຫາ 5 ອາທິດ, ບໍ່ພົບການປ່ຽນແປງທີ່ສຳຄັນໃນຄວາມສຳພັນລະຫວ່າງກະແສໄຟຟ້າ-ແຮງດັນ (ເສັ້ນໂຄ້ງ IV) (ຮູບທີ 2F). ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ບໍ່ມີເຊວປະສາດ Mfn2cKO ອາຍຸ 7 ຫາ 8 ອາທິດລອດຊີວິດຈາກການປິ່ນປົວດ້ວຍ IV (ຂັ້ນຕອນ hyperpolarization), ຊີ້ບອກວ່າມີຄວາມອ່ອນໄຫວຢ່າງຊັດເຈນຕໍ່ທ່າແຮງ hyperpolarization ໃນໄລຍະສຸດທ້າຍນີ້. ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, ໃນເຊວປະສາດ Mfn2cKO, ກະແສໄຟຟ້າ depolarizing ທີ່ເຮັດໃຫ້ເກີດການປ່ອຍປະຈຸຊ້ຳໆ (AP) ແມ່ນທົນທານຕໍ່ໄດ້ດີ, ຊີ້ບອກວ່າຮູບແບບການປ່ອຍໂດຍລວມຂອງພວກມັນບໍ່ແຕກຕ່າງກັນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍຈາກເຊວປະສາດຄວບຄຸມອາຍຸ 8 ອາທິດ (ຕາຕະລາງທີ 1 ແລະຮູບທີ 2G). ໃນທຳນອງດຽວກັນ, ຄວາມຖີ່ ແລະ ຄວາມກວ້າງຂອງກະແສໄຟຟ້າ postsynaptic ແບບ spontaneous (sPSCs) ແມ່ນທຽບເທົ່າກັບກຸ່ມຄວບຄຸມ, ແລະ ຄວາມຖີ່ຂອງເຫດການເພີ່ມຂຶ້ນຈາກ 4 ອາທິດເປັນ 5 ອາທິດເປັນ 7 ອາທິດເປັນ 8 ອາທິດ ໂດຍມີການເພີ່ມຂຶ້ນທີ່ຄ້າຍຄືກັນ (ຮູບທີ 2, H ແລະ I). ໄລຍະເວລາຂອງການເຕີບໂຕຂອງ synaptic ໃນ PNs (25). ຜົນໄດ້ຮັບທີ່ຄ້າຍຄືກັນໄດ້ຮັບຫຼັງຈາກແຜ່ນ PNs ທີ່ມີຮູ. ການຕັ້ງຄ່ານີ້ປ້ອງກັນການຊົດເຊີຍທີ່ເປັນໄປໄດ້ຂອງຂໍ້ບົກຜ່ອງ ATP ຂອງເຊວ, ດັ່ງທີ່ອາດຈະເກີດຂຶ້ນໃນການບັນທຶກແຜ່ນ clamp ຂອງເຊວທັງໝົດ. ໂດຍສະເພາະ, ທ່າແຮງຂອງເຍື່ອຫຸ້ມເຊວທີ່ພັກຜ່ອນ ແລະ ຄວາມຖີ່ຂອງການຍິງແບບ spontaneous ຂອງເຊວປະສາດ Mfn2cKO ບໍ່ໄດ້ຮັບຜົນກະທົບ (ຮູບທີ 2, J ແລະ K). ສະຫຼຸບແລ້ວ, ຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າ PNs ທີ່ມີຄວາມຜິດປົກກະຕິຂອງ OXPHOS ຢ່າງຈະແຈ້ງສາມາດຮັບມືກັບຮູບແບບການປ່ອຍຄວາມຖີ່ສູງໄດ້ດີ, ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າມີກົນໄກການຊົດເຊີຍທີ່ຊ່ວຍໃຫ້ພວກມັນຮັກສາການຕອບສະໜອງທາງໄຟຟ້າສະລີລະວິທະຍາເກືອບປົກກະຕິ.
ຂໍ້ມູນຖືກສະແດງເປັນຄ່າສະເລ່ຍ ± SEM (ການວິເຄາະຄວາມແปรປ່ວນທາງດຽວ, ການທົດສອບການປຽບທຽບຫຼາຍຄັ້ງຂອງ Holm-Sidak; *P<0.05). ໝາຍເລກຫົວໜ່ວຍຖືກລະບຸດ້ວຍວົງເລັບ.
ພວກເຮົາເລີ່ມສືບສວນວ່າໝວດໝູ່ໃດໃນຊຸດຂໍ້ມູນໂປຣຕີໂອມິກສ໌ (ຮູບທີ 1G) ປະກອບມີເສັ້ນທາງທີ່ສາມາດຕ້ານກັບການຂາດ OXPHOS ທີ່ຮ້າຍແຮງ, ດັ່ງນັ້ນຈຶ່ງອະທິບາຍວ່າເປັນຫຍັງ PN ທີ່ໄດ້ຮັບຜົນກະທົບສາມາດຮັກສາ electrophysiology ໃກ້ຈະປົກກະຕິ (ຮູບທີ 2, E ຫາ K). ການວິເຄາະໂປຣຕີໂອມິກສ໌ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າເອນໄຊມ໌ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບການເຜົາຜານຂອງກົດອະມິໂນຕ່ອງໂສ້ສາຂາ (BCAA) ໄດ້ຖືກຄວບຄຸມເພີ່ມຂຶ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ (ຮູບທີ 3A ແລະຮູບ S5A), ແລະຜະລິດຕະພັນສຸດທ້າຍ acetyl-CoA (CoA) ຫຼື succinyl CoA ສາມາດເສີມ tricarboxylates ໃນວົງຈອນ arteriosclerosis Acid (TCA). ພວກເຮົາພົບວ່າປະລິມານຂອງ BCAA transaminase 1 (BCAT1) ແລະ BCAT2 ເພີ່ມຂຶ້ນ. ພວກມັນກະຕຸ້ນຂັ້ນຕອນທຳອິດຂອງການເຜົາຜານ BCAA ໂດຍການສ້າງ glutamate ຈາກ α-ketoglutarate (26). ໜ່ວຍຍ່ອຍທັງໝົດທີ່ປະກອບເປັນສະລັບສັບຊ້ອນ keto acid dehydrogenase (BCKD) ທີ່ມີກິ່ງງ່າແມ່ນໄດ້ຮັບການເພີ່ມຂຶ້ນ (ສະລັບສັບຊ້ອນດັ່ງກ່າວເປັນຕົວກະຕຸ້ນການ decarboxylation ຕໍ່ມາ ແລະ ບໍ່ສາມາດປ່ຽນແປງໄດ້ຂອງໂຄງກະດູກຄາບອນ BCAA ທີ່ເກີດຂຶ້ນ) (ຮູບທີ 3A ແລະ ຮູບທີ S5A). ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ບໍ່ພົບການປ່ຽນແປງທີ່ຊັດເຈນໃນ BCAA ເອງໃນ PN ທີ່ຖືກຈັດລຽງ, ເຊິ່ງອາດຈະເປັນຍ້ອນການດູດຊຶມອາຊິດ amino ທີ່ຈຳເປັນເຫຼົ່ານີ້ຂອງຈຸລັງທີ່ເພີ່ມຂຶ້ນ ຫຼື ການໃຊ້ແຫຼ່ງອື່ນໆ (glucose ຫຼື lactic acid) ເພື່ອເສີມວົງຈອນ TCA (ຮູບທີ S5B). PNs ທີ່ຂາດ OXPHOS ຍັງສະແດງໃຫ້ເຫັນກິດຈະກໍາການເນົ່າເປື່ອຍ glutamine ແລະ transamination ທີ່ເພີ່ມຂຶ້ນໃນເວລາອາຍຸ 8 ອາທິດ, ເຊິ່ງສາມາດສະທ້ອນໃຫ້ເຫັນໂດຍການເພີ່ມຂຶ້ນຂອງ enzymes mitochondrial glutaminase (GLS) ແລະ glutamine pyruvate transaminase 2 (GPT2) (ຮູບທີ 3, A ແລະ C). ມັນຄວນຈະສັງເກດວ່າການເພີ່ມຂຶ້ນຂອງ GLS ແມ່ນຈຳກັດຢູ່ທີ່ isoform glutaminase C (GLS-GAC) ທີ່ເຊື່ອມຕໍ່ກັນ (ການປ່ຽນແປງຂອງ Mfn2cKO/CTRL ແມ່ນປະມານ 4.5 ເທົ່າ, P = 0.05), ແລະການເພີ່ມຂຶ້ນຂອງສະເພາະຂອງມັນໃນເນື້ອເຍື່ອມະເຮັງສາມາດສະໜັບສະໜູນພະລັງງານຊີວະພາບຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍ. (27).
(A) ແຜນທີ່ຄວາມຮ້ອນສະແດງໃຫ້ເຫັນການປ່ຽນແປງຄວາມພັບຂອງລະດັບໂປຣຕີນສຳລັບເສັ້ນທາງທີ່ລະບຸໄວ້ໃນເວລາ 8 ອາທິດ. (B) ຕົວຢ່າງຂອງຊິ້ນສ່ວນ cerebellar ທີ່ຕິດສະຫຼາກດ້ວຍພູມຕ້ານທານຕ້ານ PCx (ແຖບຂະໜາດ, 20 μm). ລູກສອນສີເຫຼືອງຊີ້ໄປທີ່ຮ່າງກາຍຂອງເຊວ Purkinje. (C) ການວິເຄາະການສະແດງອອກຂອງໂປຣຕີນຕາມໄລຍະເວລາທີ່ລະບຸວ່າເປັນຜູ້ສະໝັກທີ່ສຳຄັນສຳລັບພະຍາດ atherosclerosis (ການທົດສອບ t ຫຼາຍຄັ້ງ, *FDR <5%; n = 3-5 ໜູ). (D) ຂ້າງເທິງ: ແຜນວາດສະແດງໃຫ້ເຫັນວິທີການຕ່າງໆໃນການປ້ອນຄາບອນທີ່ຕິດສະຫຼາກທີ່ມີຢູ່ໃນຕົວຕິດຕາມ [1-13C]pyruvate (ເຊັ່ນ, ຜ່ານ PDH ຫຼືເສັ້ນທາງຜ່ານເສັ້ນເລືອດແດງ). ດ້ານລຸ່ມ: ຕາຕະລາງໄວໂອລິນສະແດງໃຫ້ເຫັນອັດຕາສ່ວນຂອງຄາບອນທີ່ຕິດສະຫຼາກດຽວ (M1) ທີ່ປ່ຽນເປັນກົດ aspartic, ກົດ citric ແລະກົດ malic ຫຼັງຈາກການຕິດສະຫຼາກຊິ້ນສ່ວນ cerebellar ສ້ວຍແຫຼມດ້ວຍ [1-13C]pyruvate (ການທົດສອບ t ຄູ່; ** P <0.01). (E) ການວິເຄາະປະຫວັດເວລາທີ່ຄົບຖ້ວນຂອງເສັ້ນທາງທີ່ລະບຸໄວ້. ພິຈາລະນາພຽງແຕ່ໂປຣຕີນທີ່ມີ P<0.05 ໃນເວລາ 8 ອາທິດ​​. ເສັ້ນປະ: ບໍ່ມີຄ່າການປັບ (ການວິເຄາະຄວາມແปรປ່ວນສອງທາງ; * P <0.05; *** P <0.001). ຂໍ້ມູນຖືກສະແດງເປັນຄ່າສະເລ່ຍ ± SEM.
ໃນການວິເຄາະຂອງພວກເຮົາ, ການເຜົາຜານ BCAA ໄດ້ກາຍເປັນໜຶ່ງໃນເສັ້ນທາງທີ່ສຳຄັນໃນການຄວບຄຸມ. ຄວາມຈິງນີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນຢ່າງແຂງແຮງວ່າປະລິມານການລະບາຍອາກາດທີ່ເຂົ້າສູ່ວົງຈອນ TCA ອາດຈະມີການປ່ຽນແປງໃນ PN ທີ່ຂາດ OXPHOS. ນີ້ອາດຈະເປັນຮູບແບບຫຼັກຂອງການເຊື່ອມຕໍ່ການເຜົາຜານອາຫານຂອງເຊວປະສາດ, ເຊິ່ງອາດຈະມີຜົນກະທົບໂດຍກົງຕໍ່ສະລີລະວິທະຍາຂອງເຊວປະສາດ ແລະ ການຢູ່ລອດໃນລະຫວ່າງການຮັກສາຄວາມຜິດປົກກະຕິຂອງ OXPHOS ທີ່ຮ້າຍແຮງ. ສອດຄ່ອງກັບສົມມຸດຕິຖານນີ້, ພວກເຮົາພົບວ່າ enzyme ຕ້ານ atherosclerotic ຫຼັກ PCx ແມ່ນຄວບຄຸມເພີ່ມຂຶ້ນ (Mfn2cKO/CTRL ປ່ຽນແປງປະມານ 1.5 ເທົ່າ; ຮູບທີ 3A), ເຊິ່ງເປັນຕົວກະຕຸ້ນການປ່ຽນ pyruvate ໄປເປັນ oxaloacetate (28), ເຊິ່ງເຊື່ອກັນວ່າຢູ່ໃນເນື້ອເຍື່ອສະໝອງ. ການສະແດງອອກໃນຖືກຈຳກັດຕໍ່ astrocytes (29, 30). ສອດຄ່ອງກັບຜົນໄດ້ຮັບຂອງ proteomics, ກ້ອງຈຸລະທັດ confocal ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າການສະແດງອອກຂອງ PCx ໄດ້ເພີ່ມຂຶ້ນໂດຍສະເພາະ ແລະ ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນ PNs ທີ່ຂາດ OXPHOS, ໃນຂະນະທີ່ປະຕິກິລິຍາ PCx ສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນຖືກຈຳກັດຕໍ່ຈຸລັງ glial Bergmann ທີ່ຢູ່ຕິດກັນຂອງການຄວບຄຸມ (ຮູບທີ 3B). ເພື່ອທົດສອບການເພີ່ມຂຶ້ນຂອງ PCx ທີ່ສັງເກດເຫັນໄດ້ຢ່າງມີປະສິດທິພາບ, ພວກເຮົາໄດ້ປິ່ນປົວຊິ້ນສ່ວນ cerebellar ສ້ວຍແຫຼມດ້ວຍຕົວຕິດຕາມ [1-13C]pyruvate. ເມື່ອ pyruvate ຖືກຜຸພັງໂດຍ pyruvate dehydrogenase (PDH), ປ້າຍ isotope ຂອງມັນຫາຍໄປ, ແຕ່ຖືກລວມເຂົ້າໃນຕົວກາງຂອງວົງຈອນ TCA ເມື່ອ pyruvate ຖືກເຜົາຜານໂດຍປະຕິກິລິຍາຂອງຫຼອດເລືອດ (ຮູບທີ 3D). ເພື່ອສະໜັບສະໜູນຂໍ້ມູນ proteomics ຂອງພວກເຮົາ, ພວກເຮົາໄດ້ສັງເກດເຫັນເຄື່ອງໝາຍຈຳນວນຫຼວງຫຼາຍຈາກຕົວຕິດຕາມນີ້ໃນກົດ aspartic ຂອງຊິ້ນສ່ວນ Mfn2cKO, ໃນຂະນະທີ່ກົດ citric ແລະກົດ malic ຍັງມີທ່າອ່ຽງປານກາງ, ເຖິງແມ່ນວ່າບໍ່ມີຄວາມສຳຄັນ (ຮູບທີ 3D).
ໃນເຊວປະສາດໂດປາມີນຂອງໜູ MitoPark ທີ່ມີຄວາມຜິດປົກກະຕິຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍທີ່ເກີດຈາກເຊວປະສາດໂດປາມີນທີ່ທຳລາຍເຊື້ອພັນທຸກໍາປັດໄຈການຖອດລະຫັດໄມໂທຄອນເດຣຍ A (Tfam) (ຮູບ S6B), ການສະແດງອອກຂອງ PCx ຍັງເພີ່ມຂຶ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ (31), ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າການເກີດພະຍາດເສັ້ນເລືອດແຂງຕົວອາຊິດອາເຊໂຕນ. ການເກີດຂຶ້ນຂອງພະຍາດດັ່ງກ່າວຖືກຄວບຄຸມໃນລະຫວ່າງການເຮັດວຽກຜິດປົກກະຕິຂອງ OXPHOS ຂອງເຊວປະສາດໃນຮ່າງກາຍ. ມັນຄວນຈະສັງເກດວ່າມັນໄດ້ພົບເຫັນວ່າເອນໄຊມ໌ທີ່ເປັນເອກະລັກ (32-34) ທີ່ອາດຈະສະແດງອອກໃນເຊວປະສາດທີ່ອາດຈະກ່ຽວຂ້ອງກັບການເສັ້ນເລືອດແຂງຕົວແມ່ນເພີ່ມຂຶ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນ PNs ທີ່ຂາດ OXPHOS, ເຊັ່ນ propionyl-CoA carboxylase (PCC-A), Malonyl-CoA ປ່ຽນ propionyl-CoA ໄປເປັນ succinyl-CoA ແລະ ເອນໄຊມ໌ malic ໄມໂທຄອນເດຣຍ 3 (ME3), ເຊິ່ງມີບົດບາດຫຼັກໃນການຟື້ນຟູ pyruvate ຈາກ malate (ຮູບ 3, A ແລະ C) (33, 35). ນອກຈາກນັ້ນ, ພວກເຮົາຍັງພົບການເພີ່ມຂຶ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນເອນໄຊມ Pdk3, ເຊິ່ງຟອສຟໍຣິເລດ ແລະ ດັ່ງນັ້ນຈຶ່ງເຮັດໃຫ້ PDH ບໍ່ເຮັດວຽກ (36), ໃນຂະນະທີ່ບໍ່ມີການປ່ຽນແປງໃດໆທີ່ຖືກກວດພົບໃນເອນໄຊມ Pdp1 ທີ່ກະຕຸ້ນ PDH ຫຼື ສະລັບສັບຊ້ອນເອນໄຊມ PDH ເອງ (ຮູບທີ 3A). ຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງ, ໃນ Mern2cKO PNs, ການຟອສຟໍຣິເລດຂອງຫນ່ວຍຍ່ອຍ α1 α (PDHE1α) ຂອງອົງປະກອບ pyruvate dehydrogenase E1 ຂອງສະລັບສັບຊ້ອນ PDH ໃນ Ser293 (ທີ່ຮູ້ຈັກວ່າຍັບຍັ້ງກິດຈະກໍາຂອງເອນໄຊມຂອງ PDH) ໄດ້ຮັບການປັບປຸງ (ຮູບ S6C) (ຮູບ S6C). Pyruvate ບໍ່ມີການເຂົ້າເຖິງເສັ້ນເລືອດ.
ສຸດທ້າຍ, ພວກເຮົາພົບວ່າເສັ້ນທາງສຸດຍອດຂອງການສັງເຄາະ serine ແລະ glycine, ວົງຈອນ mitochondrial folate (1C) ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງ ແລະ ການສັງເຄາະ proline (ຮູບທີ 1G ແລະ ຮູບທີ S5C) ລ້ວນແຕ່ຖືກຄວບຄຸມເພີ່ມຂຶ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ, ອີງຕາມລາຍງານ, ໃນລະຫວ່າງຂະບວນການກະຕຸ້ນ. ເນື້ອເຍື່ອອ້ອມຂ້າງຖືກກະຕຸ້ນດ້ວຍຄວາມຜິດປົກກະຕິຂອງ mitochondrial (5-7). ການວິເຄາະ confocal ທີ່ສະໜັບສະໜູນຂໍ້ມູນ proteomics ເຫຼົ່ານີ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າໃນ PN ທີ່ຂາດ OXPHOS, ຊິ້ນສ່ວນ cerebellar ຂອງໜູອາຍຸ 8 ອາທິດໄດ້ຮັບ serine hydroxymethyltransferase 2 (SHMT2), ເຊິ່ງເປັນ enzyme ທີ່ສຳຄັນຂອງວົງຈອນ folate ຂອງ mitochondrial. ການຕອບສະໜອງຂອງພູມຕ້ານທານທີ່ສຳຄັນ (ຮູບທີ S5D). ໃນຊິ້ນສ່ວນ cerebellar ສ້ວຍແຫຼມ 13 ຊິ້ນທີ່ຖືກ CU-glucose incubated, ການທົດລອງຕິດຕາມການເຜົາຜານອາຫານໄດ້ຢືນຢັນຕື່ມອີກເຖິງການເພີ່ມຂຶ້ນຂອງການສັງເຄາະ serine ແລະ proline, ຊີ້ບອກວ່າການໄຫຼຂອງ carbon isoforms ເຂົ້າໄປໃນ serine ແລະ proline ເພີ່ມຂຶ້ນ (ຮູບທີ S5E). ເນື່ອງຈາກປະຕິກິລິຍາທີ່ສົ່ງເສີມໂດຍ GLS ແລະ GPT2 ແມ່ນຮັບຜິດຊອບຕໍ່ການສັງເຄາະ glutamate ຈາກ glutamate ແລະ transamination ລະຫວ່າງ glutamate ແລະ α-ketoglutarate, ການເພີ່ມຂຶ້ນຂອງພວກມັນຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າ neurons ທີ່ຂາດ OXPHOS ມີຄວາມຕ້ອງການ glutamate ເພີ່ມຂຶ້ນ, ນີ້ອາດຈະມີຈຸດປະສົງເພື່ອຮັກສາການສັງເຄາະທາງຊີວະພາບທີ່ເພີ່ມຂຶ້ນຂອງ proline (ຮູບ S5C). ກົງກັນຂ້າມກັບການປ່ຽນແປງເຫຼົ່ານີ້, ການວິເຄາະໂປຣຕີນຂອງ cerebellar astrocytes ຈາກໜູ Mfn2cKO ສະເພາະ PN ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າເສັ້ນທາງເຫຼົ່ານີ້ (ລວມທັງ antiperoxidases ທັງໝົດ) ບໍ່ມີການປ່ຽນແປງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນການສະແດງອອກ, ດັ່ງນັ້ນຈຶ່ງສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າການປ່ຽນເສັ້ນທາງການເຜົາຜານອາຫານນີ້ແມ່ນເລືອກໄປສູ່ PN ທີ່ເສື່ອມໂຊມ (ຮູບ S6, D ຫາ G).
ສະຫຼຸບແລ້ວ, ການວິເຄາະເຫຼົ່ານີ້ໄດ້ເປີດເຜີຍຮູບແບບທີ່ແຕກຕ່າງກັນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍຂອງການກະຕຸ້ນຊົ່ວຄາວຂອງເສັ້ນທາງການເຜົາຜານອາຫານສະເພາະໃນ PNs. ເຖິງແມ່ນວ່າໜ້າທີ່ຜິດປົກກະຕິຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍຂອງເຊວປະສາດສາມາດນຳໄປສູ່ພະຍາດເສັ້ນເລືອດແຂງໃນໄລຍະຕົ້ນ ແລະ ການປ່ຽນແປງຂອງ 1C (ຮູບທີ 3E ແລະ ຮູບທີ S5C), ແລະ ແມ່ນແຕ່ການປ່ຽນແປງທີ່ຄາດເດົາໄດ້ໃນການສະແດງອອກຂອງສະລັບສັບຊ້ອນ I ແລະ IV, ການປ່ຽນແປງໃນການສັງເຄາະ serine de novo ແມ່ນເຫັນໄດ້ຊັດເຈນພຽງແຕ່ໃນໄລຍະທ້າຍໆເທົ່ານັ້ນ. ຄວາມຜິດປົກກະຕິຂອງ OXPHOS (ຮູບທີ 3E ແລະ ຮູບທີ S5C). ການຄົ້ນພົບເຫຼົ່ານີ້ກຳນົດຂະບວນການຕາມລຳດັບທີ່ໄມໂທຄອນເດຣຍທີ່ເກີດຈາກຄວາມກົດດັນ (ວົງຈອນ 1C) ແລະ ໄຊໂຕພລາສຊຶມ (ຊີວະສັງເຄາະ serine) ຕອບສະໜອງຮ່ວມກັນກັບການເພີ່ມຂຶ້ນຂອງພະຍາດເສັ້ນເລືອດແຂງໃນວົງຈອນ TCA ເພື່ອປັບປຸງການເຜົາຜານອາຫານຂອງເຊວປະສາດ.
PNs ອາຍຸ 8 ອາທິດທີ່ຂາດ OXPHOS ສາມາດຮັກສາກິດຈະກຳການກະຕຸ້ນຄວາມຖີ່ສູງ ແລະ ຜ່ານການເຊື່ອມຕໍ່ທາງເມຕາໂບລິກທີ່ສຳຄັນເພື່ອຊົດເຊີຍການເຮັດວຽກຜິດປົກກະຕິຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍ. ການຄົ້ນພົບນີ້ເຮັດໃຫ້ເກີດຄວາມເປັນໄປໄດ້ທີ່ໜ້າສົນໃຈວ່າເຖິງແມ່ນວ່າໃນເວລານີ້, ຈຸລັງເຫຼົ່ານີ້ອາດຈະໄດ້ຮັບການແຊກແຊງການປິ່ນປົວເພື່ອຊັກຊ້າ ຫຼື ປ້ອງກັນການເສື່ອມສະພາບຂອງລະບົບປະສາດ. ຊ້າ. ພວກເຮົາໄດ້ແກ້ໄຂຄວາມເປັນໄປໄດ້ນີ້ຜ່ານການແຊກແຊງເອກະລາດສອງຢ່າງ. ໃນວິທີການທຳອິດ, ພວກເຮົາໄດ້ອອກແບບເວັກເຕີໄວຣັດທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ adeno (AAV) ທີ່ຂຶ້ນກັບ Cre ເພື່ອໃຫ້ MFN2 ສາມາດສະແດງອອກຢ່າງເລືອກເຟັ້ນໃນ PNs ທີ່ຂາດ OXPHOS ໃນຮ່າງກາຍ (ຮູບ S7A). AAV ທີ່ເຂົ້າລະຫັດ MFN2 ແລະ gene ລາຍງານ fluorescent mCherry (Mfn2-AAV) ໄດ້ຖືກຢືນຢັນໃນການເພາະເລี้ยงເຊວປະສາດຂັ້ນຕົ້ນໃນຫຼອດທົດລອງ, ເຊິ່ງເຮັດໃຫ້ MFN2 ຖືກສະແດງອອກໃນລັກສະນະທີ່ຂຶ້ນກັບ Cre ແລະ ຊ່ວຍເຫຼືອຮູບຮ່າງຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍ, ດັ່ງນັ້ນຈຶ່ງປ້ອງກັນການກາຍພັນຂອງເຊວປະສາດໃນເຊວປະສາດ Mfn2cKO (ຮູບ S7, B, D ແລະ E). ຕໍ່ໄປ, ພວກເຮົາໄດ້ດຳເນີນການທົດລອງໃນຮ່າງກາຍເພື່ອສົ່ງ Mfn2-AAV ອາຍຸ 8 ອາທິດໄປຫາ cortex cerebellar ຂອງໜູ Mfn2cKO ແລະ ໜູຄວບຄຸມແບບ stereotactic, ແລະວິເຄາະໜູອາຍຸ 12 ອາທິດ (ຮູບທີ 4A). ໜູ Mfn2cKO ທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວໄດ້ຕາຍ (ຮູບທີ 1, A ແລະ B) (16). ການສົ່ງຕໍ່ໄວຣັດໃນຮ່າງກາຍເຮັດໃຫ້ເກີດການສະແດງອອກທີ່ເລືອກຂອງ PN ໃນວົງ cerebellar ບາງອັນ (ຮູບ S7, G ແລະ H). ການສັກ AAV ຄວບຄຸມທີ່ສະແດງອອກພຽງແຕ່ mCherry (Ctrl-AAV) ບໍ່ມີຜົນກະທົບທີ່ສຳຄັນຕໍ່ລະດັບຂອງການເສື່ອມສະພາບຂອງລະບົບປະສາດໃນສັດ Mfn2cKO. ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, ການວິເຄາະ Mfn2cKOs ທີ່ສົ່ງຕໍ່ດ້ວຍ Mfn2-AAV ສະແດງໃຫ້ເຫັນຜົນກະທົບປ້ອງກັນທີ່ສຳຄັນຂອງຊັ້ນເຊວ PN (ຮູບທີ 4, B ແລະ C). ໂດຍສະເພາະ, ຄວາມໜາແໜ້ນຂອງເຊວປະສາດເບິ່ງຄືວ່າເກືອບຈະແຍກບໍ່ອອກຈາກສັດຄວບຄຸມ (ຮູບທີ 4, B ແລະ C, ແລະຮູບ S7, H ແລະ I). ການສະແດງອອກຂອງ MFN1 ແຕ່ບໍ່ແມ່ນ MFN2 ແມ່ນມີປະສິດທິພາບເທົ່າທຽມກັນໃນການຊ່ວຍປະຢັດການຕາຍຂອງເສັ້ນປະສາດ (ຮູບທີ 4C ແລະຮູບທີ S7, C ແລະ F), ເຊິ່ງຊີ້ບອກວ່າການສະແດງອອກຂອງ MFN1 ທີ່ບໍ່ສົມບູນແບບສາມາດເສີມການຂາດ MFN2 ໄດ້ຢ່າງມີປະສິດທິພາບ. ການວິເຄາະຕື່ມອີກໃນລະດັບ PN ດຽວສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ Mfn2-AAV ສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນຊ່ວຍກູ້ໂຄງສ້າງພິເສດຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍ, ເຮັດໃຫ້ລະດັບ mtDNA ປົກກະຕິ, ແລະປີ້ນກັບການສະແດງອອກສູງຂອງເຄື່ອງໝາຍຕ້ານການສ້າງເສັ້ນເລືອດໃໝ່ PCx (ຮູບທີ 4, C ຫາ E). ການກວດກາດ້ວຍສາຍຕາຂອງໜູ Mfn2cKO ທີ່ຖືກຊ່ວຍເຫຼືອໃນສະພາບພັກຜ່ອນສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າທ່າທາງແລະອາການຂອງການເຄື່ອນໄຫວ (ການເຄື່ອນໄຫວ S1 ຫາ S3) ຂອງພວກມັນໄດ້ຮັບການປັບປຸງ. ສະຫຼຸບແລ້ວ, ການທົດລອງເຫຼົ່ານີ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າການນຳ MFN2 ກັບຄືນສູ່ PNs ທີ່ຂາດ OXPHOS ຢ່າງຮ້າຍແຮງແມ່ນພຽງພໍທີ່ຈະປີ້ນກັບການບໍລິໂພກ mtDNA ແລະກະຕຸ້ນໃຫ້ເກີດເສັ້ນເລືອດແຂງ, ດັ່ງນັ້ນຈຶ່ງປ້ອງກັນການເສື່ອມສະພາບຂອງແກນກາງແລະການຕາຍຂອງເສັ້ນປະສາດໃນຮ່າງກາຍ.
(A) ແຜນວາດສະແດງຕາຕະລາງການທົດລອງສຳລັບການສັກ AAV ທີ່ເຂົ້າລະຫັດ MFN2 ເມື່ອເສັ້ນທາງການເຜົາຜານອາຫານທີ່ລະບຸໄວ້ຖືກກະຕຸ້ນ. (B) ຮູບພາບ confocal ທີ່ເປັນຕົວແທນຂອງຊິ້ນສ່ວນ cerebellar ອາຍຸ 12 ອາທິດທີ່ຖືກ transduced ໃນເວລາ 8 ອາທິດໃນໜູ Mfn2cKO ແລະຕິດສະຫຼາກດ້ວຍພູມຕ້ານທານຕ້ານ Calbindin. ຂວາ: ການຂະຫຍາຍຂອງເສັ້ນໃຍ axon. ຂະໜາດຂອງການຊູມ axon ແມ່ນ 450 ແລະ 75 μm. (C) ຊ້າຍ: ການວັດແທກຄວາມໜາແໜ້ນຂອງຈຸລັງ Purkinje ໃນວົງວຽນການ transduction AAV (AAV+) (ການວິເຄາະຄວາມແปรປ່ວນທາງດຽວ; n = 3 ໜູ). ຂວາ: ການວິເຄາະຈຸດສຸມ mtDNA ໃນ PN ທີ່ຖືກ transduced ໃນອາທິດທີ 12 (ການທົດສອບ t ທີ່ບໍ່ໄດ້ຈັບຄູ່; n = 6 ຈຸລັງຈາກໜູສາມໂຕ). * P <0.05; ** P <0.01. (D) ຮູບຖ່າຍຈຸລະທັດເອເລັກຕຣອນສົ່ງຕໍ່ທີ່ເປັນຕົວແທນຂອງ PNs ຂອງພາກສ່ວນ cerebellar Mfn2cKO ທີ່ຖືກ transduced ດ້ວຍເວັກເຕີໄວຣັດທີ່ລະບຸໄວ້. ໜ້າກາກສີບົວສະແດງໃຫ້ເຫັນພື້ນທີ່ທີ່ຄອບຄອງໂດຍ dendrites, ແລະຈຸດສີເຫຼືອງສີ່ຫຼ່ຽມມົນສະແດງໃຫ້ເຫັນການຊູມທີ່ສະໜອງໃຫ້ຢູ່ເບື້ອງຂວາ; n ເປັນຕົວແທນຂອງນິວເຄຼຍສ. ແຖບມາດຕາສ່ວນ, 1μm. (E) ສະແດງຕົວຢ່າງຂອງການຍ້ອມສີ PCx ໃນ PN ທີ່ຖືກຖ່າຍທອດໃນເວລາ 12 ອາທິດ. ແຖບມາດຕາສ່ວນ, 20μm. OE, ການສະແດງອອກຫຼາຍເກີນໄປ; FC, ການປ່ຽນແປງຂອງພັບ.
ສຸດທ້າຍ, ພວກເຮົາໄດ້ສືບສວນຄວາມສຳຄັນຂອງການຢູ່ລອດຂອງເຊວທີ່ເກີດຈາກ peroxidase ໃນ PNs ທີ່ປະສົບກັບຄວາມຜິດປົກກະຕິຂອງ OXPHOS. ພວກເຮົາໄດ້ສ້າງ mCherry ທີ່ເຂົ້າລະຫັດ AAV-shRNA (RNA ຜົມສັ້ນ) ທີ່ແນໃສ່ mRNA PCx ຂອງໜູ (AAV-shPCx) ໂດຍສະເພາະ, ແລະສັກເຊື້ອໄວຣັສ ຫຼື ເຊື້ອໄວຣັສຄວບຄຸມທີ່ສັບສົນ (AAV-scr) ເຂົ້າໄປໃນ cerebellum ຂອງໜູ Mfn2cKO. ການສັກຢາໄດ້ປະຕິບັດໃນອາທິດທີສີ່ຂອງອາຍຸ (ຮູບທີ 5A) ເພື່ອໃຫ້ PCx ຖືກລົບລ້າງຢ່າງມີປະສິດທິພາບໃນຊ່ວງເວລາທີ່ການສະແດງອອກຂອງ PCx ເພີ່ມຂຶ້ນ (ຮູບທີ 3C) ແລະຊັ້ນເຊວ PN ຍັງຄົງຢູ່ (ຮູບທີ 1A). ມັນຄວນຈະສັງເກດວ່າການລົບລ້າງ PCx (ຮູບທີ S8A) ນຳໄປສູ່ການເລັ່ງການຕາຍຂອງ PN ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ, ເຊິ່ງຈຳກັດຢູ່ໃນວົງແຫວນທີ່ຕິດເຊື້ອ (ຮູບທີ 5, B ແລະ C). ເພື່ອເຂົ້າໃຈກົນໄກຂອງຜົນກະທົບທາງເມຕາໂບລິກທີ່ເກີດຈາກການເພີ່ມຂຶ້ນຂອງ PCx, ພວກເຮົາໄດ້ສຶກສາສະຖານະພາບ redox ຂອງ PNs ຫຼັງຈາກການ knockdown ຂອງ PCx ແລະເຊັນເຊີໄບໂອເຕີແສງທີ່ໄກ່ເກ່ຍໂດຍ AAV Grx1-roGFP2 ໄດ້ຖືກສະແດງອອກພ້ອມໆກັນ (ຮູບ S8, B ຫາ D) ເພື່ອປະເມີນການປ່ຽນແປງທີ່ກ່ຽວຂ້ອງຂອງທ່າແຮງ redox peptide (38). ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ພວກເຮົາໄດ້ປະຕິບັດກ້ອງຈຸລະທັດສະແກນພາບຕະຫຼອດຊີວິດທີ່ມີແສງສອງໂຟຕອນ (FLIM) ໃນຊິ້ນສ່ວນສະໝອງສ້ວຍແຫຼມຂອງ Mfn2cKO ອາຍຸ 7 ອາທິດ ຫຼື ຄູ່ຄວບຄຸມເພື່ອກວດຫາການປ່ຽນແປງທີ່ອາດເກີດຂຶ້ນໃນສະຖານະພາບ redox cytoplasmic ຫຼັງຈາກການກວດສອບເງື່ອນໄຂ FLIM (ຮູບ S8, E ຫາ G). ການວິເຄາະສະແດງໃຫ້ເຫັນການເພີ່ມຂຶ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນສະຖານະການຜຸພັງຂອງ Mfn2cKO PNs ດຽວທີ່ຂາດການສະແດງອອກ PCx, ເຊິ່ງແຕກຕ່າງຈາກເຊວປະສາດຄວບຄຸມ ຫຼື Mfn2cKO PNs ທີ່ສະແດງອອກພຽງແຕ່ shRNA ທີ່ຖືກລົບກວນ (ຮູບ 5, D ແລະ E). ເມື່ອການສະແດງອອກຂອງ PCx ຖືກຫຼຸດລົງ, ອັດຕາສ່ວນຂອງ Mfn2cKO PNs ທີ່ສະແດງໃຫ້ເຫັນສະພາບທີ່ຖືກຜຸພັງສູງເພີ່ມຂຶ້ນຫຼາຍກວ່າສາມເທົ່າ (ຮູບທີ 5E), ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າການເພີ່ມຂຶ້ນຂອງ PCx ຮັກສາຄວາມສາມາດໃນການ redox ຂອງ neurons ທີ່ເສື່ອມໂຊມ.
(A) ແຜນວາດສະແດງຕາຕະລາງການທົດລອງສຳລັບການສັກ AAV ທີ່ເຂົ້າລະຫັດ shPCx ເມື່ອເສັ້ນທາງການເຜົາຜານອາຫານທີ່ລະບຸໄວ້ຖືກກະຕຸ້ນ. (B) ຮູບຖ່າຍ confocal ທີ່ເປັນຕົວແທນຂອງພາກສ່ວນ cerebellar ອາຍຸ 8 ອາທິດໃນໜູ Mfn2cKO ທີ່ຖືກ transduced ແລະຕິດສະຫຼາກດ້ວຍພູມຕ້ານທານຕ້ານ calcineurin ໃນເວລາ 4 ອາທິດ. ແຖບຂະໜາດ, 450μm. (C) ການວັດແທກປະລິມານຂອງຄວາມໜາແໜ້ນຂອງຈຸລັງ Purkinje ໃນວົງວຽນທີ່ transduced AAV (ການວິເຄາະຄວາມແปรປ່ວນທາງດຽວ; n = 3 ຫາ 4 ໜູ). ຂໍ້ມູນຖືກສະແດງເປັນຄ່າສະເລ່ຍ ± SEM; ***P<0.001. (D) ຮູບພາບ FLIM ທີ່ເປັນຕົວແທນສະແດງໃຫ້ເຫັນອາຍຸສະເລ່ຍຂອງເຊັນເຊີ glutathione redox ອາຍຸ 7 ອາທິດທີ່ສະແດງອອກ PN Grx1-roGFP2 ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂການທົດລອງທີ່ລະບຸໄວ້. ອັດຕາສ່ວນ LUT (ຕາຕະລາງຊອກຫາ): ໄລຍະເວລາການຢູ່ລອດ (ເປັນ picoseconds). ແຖບຂະໜາດ, 25μm. (E) ຮິສໂຕແກຣມສະແດງໃຫ້ເຫັນການແຈກຢາຍຂອງຄ່າຕະຫຼອດຊີວິດຂອງ Grx1-roGFP2 ຈາກ (D) (n=158 ຫາ 368 ຈຸລັງໃນໜູສອງໂຕພາຍໃຕ້ແຕ່ລະເງື່ອນໄຂ). ຕາຕະລາງວົງມົນຂ້າງເທິງແຕ່ລະຮິສໂຕແກຣມ: ສະແດງໃຫ້ເຫັນຈຳນວນຈຸລັງທີ່ມີຄ່າອາຍຸຍືນຍາວກວ່າ (ສີແດງ, ຜຸພັງ) ຫຼືສັ້ນກວ່າ (ສີຟ້າ, ຫຼຸດລົງ), ເຊິ່ງເກີນ 1 SD ຂອງຄ່າອາຍຸຍືນສະເລ່ຍໃນ CTRL-AAV-scr. (F) ຮູບແບບທີ່ສະເໜີສະແດງໃຫ້ເຫັນຜົນກະທົບປ້ອງກັນຂອງການເພີ່ມຂຶ້ນຂອງ PCx ຂອງເຊວປະສາດ.
ໂດຍລວມແລ້ວ, ຂໍ້ມູນທີ່ພວກເຮົາສະໜອງໃຫ້ຢູ່ນີ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າການສະແດງອອກຄືນໃໝ່ຂອງ MFN2 ສາມາດຊ່ວຍ PN ຂັ້ນສູງໄດ້ຢ່າງສົມບູນດ້ວຍການຂາດ OXPHOS ຮ້າຍແຮງ, ການຫຼຸດລົງຂອງ mtDNA ຮ້າຍແຮງ, ແລະຮູບຮ່າງຄ້າຍຄື ista ທີ່ຜິດປົກກະຕິທີ່ສຸດ, ດັ່ງນັ້ນຈຶ່ງສະໜອງຄວາມຄືບໜ້າຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງເຖິງແມ່ນວ່າໃນພະຍາດຂັ້ນສູງ. ການເສື່ອມສະພາບຂອງລະບົບປະສາດໃຫ້ຫຼັກຖານທີ່ສາມາດປີ້ນກັບໄດ້ຂອງຂັ້ນຕອນກ່ອນການຕາຍຂອງເຊວ. ລະດັບຄວາມຍືດຫຍຸ່ນໃນການເຜົາຜານອາຫານນີ້ຍັງຖືກເນັ້ນໜັກຕື່ມອີກໂດຍຄວາມສາມາດຂອງເຊວປະສາດໃນການກະຕຸ້ນເສັ້ນເລືອດແຂງ (ການເຊື່ອມຕໍ່ໃໝ່ຂອງວົງຈອນ TCA), ເຊິ່ງຍັບຍັ້ງການສະແດງອອກຂອງ PCx ໃນ PNs ທີ່ຂາດ OXPHOS ແລະເສີມຂະຫຍາຍການຕາຍຂອງເຊວ, ດັ່ງນັ້ນຈຶ່ງມີບົດບາດປ້ອງກັນ (ຮູບທີ 5F).
ໃນການສຶກສາຄັ້ງນີ້, ພວກເຮົາໄດ້ສະໜອງຫຼັກຖານວ່າການຕອບສະໜອງຂອງ PNs ຕໍ່ກັບຄວາມຜິດປົກກະຕິຂອງ OXPHOS ແມ່ນເພື່ອຄ່ອຍໆລວມເຂົ້າກັບພະຍາດ atherosclerosis ຂອງວົງຈອນ TCA ຜ່ານເສັ້ນທາງການກະຕຸ້ນທີ່ແຕກຕ່າງກັນທີ່ຖືກກະຕຸ້ນໂດຍໂປຣແກຣມການເຜົາຜານອາຫານ. ພວກເຮົາໄດ້ຢືນຢັນການວິເຄາະໂປຣຕີໂອມິກດ້ວຍວິທີການເສີມຫຼາຍຢ່າງ ແລະ ເປີດເຜີຍວ່າເມື່ອຖືກທ້າທາຍໂດຍຄວາມຜິດປົກກະຕິຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍທີ່ຮ້າຍແຮງ, ເຊວປະສາດມີຮູບແບບຄວາມຍືດຫຍຸ່ນຂອງການເຜົາຜານອາຫານທີ່ບໍ່ຮູ້ຈັກມາກ່ອນ. ພວກເຮົາແປກໃຈທີ່ຂະບວນການເຊື່ອມຕໍ່ຄືນໃໝ່ທັງໝົດບໍ່ຈຳເປັນຕ້ອງໝາຍເຖິງສະຖານະການເຜົາຜານອາຫານສຸດທ້າຍທີ່ມາພ້ອມກັບການເສື່ອມສະພາບຂອງລະບົບປະສາດເທື່ອລະກ້າວ ແລະ ບໍ່ສາມາດກັບຄືນໄດ້, ແຕ່ຂໍ້ມູນຂອງພວກເຮົາຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າມັນອາດຈະປະກອບເປັນເຊວປະສາດທີ່ຮັກສາໄວ້ເຖິງແມ່ນວ່າຢູ່ໃນໄລຍະກ່ອນການຕາຍຂອງເຊວ. ກົນໄກການຊົດເຊີຍການເຮັດວຽກ. ການຄົ້ນພົບນີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າເຊວປະສາດມີຄວາມຍືດຫຍຸ່ນໃນການເຜົາຜານອາຫານໃນລະດັບທີ່ສຳຄັນໃນຮ່າງກາຍ. ຄວາມຈິງນີ້ພິສູດວ່າການນຳສະເໜີ MFN2 ຄືນໃໝ່ໃນພາຍຫຼັງສາມາດປີ້ນກັບການສະແດງອອກຂອງເຄື່ອງໝາຍການເຜົາຜານອາຫານທີ່ສຳຄັນ ແລະ ປ້ອງກັນການເສື່ອມສະພາບຂອງ PN. ໃນທາງກົງກັນຂ້າມ, ມັນຍັບຍັ້ງເສັ້ນເລືອດແຂງ ແລະ ເລັ່ງເສັ້ນປະສາດ. ຜູ້ປ່ຽນເພດ.
ໜຶ່ງໃນການຄົ້ນພົບທີ່ໜ້າສົນໃຈທີ່ສຸດໃນການຄົ້ນຄວ້າຂອງພວກເຮົາແມ່ນວ່າ PNs ທີ່ຂາດ OXPHOS ສາມາດດັດແປງການເຜົາຜານອາຫານຂອງວົງຈອນ TCA ໂດຍການຄວບຄຸມເອນໄຊມ໌ທີ່ກະຕຸ້ນການແຂງຕົວຂອງເສັ້ນເລືອດແດງໂດຍສະເພາະ. ການຈັດລຽງການເຜົາຜານອາຫານຄືນໃໝ່ແມ່ນລັກສະນະທົ່ວໄປຂອງຈຸລັງມະເຮັງ, ເຊິ່ງບາງຈຸລັງອາໄສ glutamine ເພື່ອເສີມຕົວກາງຂອງວົງຈອນ TCA ເພື່ອຜະລິດສານທີ່ຫຼຸດຜ່ອນ, ເຊິ່ງຂັບເຄື່ອນລະບົບຕ່ອງໂສ້ການຫາຍໃຈ ແລະ ຮັກສາການຜະລິດສານຕັ້ງຕົ້ນຂອງການສັງເຄາະໄຂມັນ ແລະ ນິວຄລີໂອໄທດ໌ (39, 40). ການສຶກສາທີ່ຜ່ານມາສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າໃນເນື້ອເຍື່ອອ້ອມຂ້າງທີ່ປະສົບກັບຄວາມຜິດປົກກະຕິຂອງ OXPHOS, ການເຊື່ອມຕໍ່ຄືນໃໝ່ຂອງການເຜົາຜານອາຫານ glutamine/glutamate ຍັງເປັນລັກສະນະທີ່ໂດດເດັ່ນ (5, 41), ບ່ອນທີ່ທິດທາງຂອງການເຂົ້າສູ່ວົງຈອນ TCA ແມ່ນຂຶ້ນກັບ ເນື່ອງຈາກຄວາມຮຸນແຮງຂອງການບາດເຈັບ OXPHOS (41). ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ຍັງຂາດຫຼັກຖານທີ່ຊັດເຈນກ່ຽວກັບຄວາມຄ້າຍຄືກັນຂອງຄວາມຍືດຫຍຸ່ນຂອງການເຜົາຜານອາຫານຂອງເສັ້ນປະສາດໃນຮ່າງກາຍ ແລະ ຄວາມກ່ຽວຂ້ອງທີ່ເປັນໄປໄດ້ຂອງມັນໃນສະພາບການຂອງພະຍາດ. ໃນການສຶກສາໃນຫຼອດທົດລອງທີ່ຜ່ານມາ, ເສັ້ນປະສາດ cortical ປະຖົມໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າລະດົມສະລອຍນ້ຳ glutamate ສຳລັບການຖ່າຍທອດທາງເສັ້ນປະສາດ, ດັ່ງນັ້ນຈຶ່ງສົ່ງເສີມການເຜົາຜານອາຫານອົກຊີເດຊັນ ແລະ ພະຍາດເສັ້ນເລືອດແຂງພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂຄວາມກົດດັນທາງເມຕາບໍລິກ (42). ມັນຄວນຈະສັງເກດວ່າພາຍໃຕ້ການຍັບຍັ້ງທາງດ້ານການຢາຂອງ enzyme succinate dehydrogenase ຂອງວົງຈອນ TCA, pyruvate carboxylation ເຊື່ອກັນວ່າຮັກສາການສັງເຄາະຂອງ oxaloacetate ໃນ neurons cerebellum granule ທີ່เพาะเลี้ยง (34). ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ຄວາມກ່ຽວຂ້ອງທາງສະລີລະວິທະຍາຂອງກົນໄກເຫຼົ່ານີ້ກັບເນື້ອເຍື່ອສະໝອງ (ບ່ອນທີ່ເຊື່ອກັນວ່າ atherosclerosis ສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນຖືກຈຳກັດຢູ່ໃນ astrocytes) ຍັງມີຄວາມສຳຄັນທາງສະລີລະວິທະຍາທີ່ສຳຄັນ (43). ໃນກໍລະນີນີ້, ຂໍ້ມູນຂອງພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ PNs ທີ່ເສຍຫາຍໂດຍ OXPHOS ໃນຮ່າງກາຍສາມາດປ່ຽນໄປເປັນການເສື່ອມສະພາບ BCAA ແລະ pyruvate carboxylation, ເຊິ່ງເປັນສອງແຫຼ່ງຫຼັກຂອງການເສີມຂອງຕົວກາງ TCA pool. ເຖິງແມ່ນວ່າການປະກອບສ່ວນທີ່ສົມມຸດຕິຖານຂອງ catabolism BCAA ຕໍ່ການເຜົາຜານພະລັງງານຂອງ neuronal ໄດ້ຖືກສະເໜີແລ້ວ, ນອກເໜືອໄປຈາກບົດບາດຂອງ glutamate ແລະ GABA ສຳລັບການຖ່າຍທອດ neurotransmission (44), ຍັງບໍ່ມີຫຼັກຖານສຳລັບກົນໄກເຫຼົ່ານີ້ໃນຮ່າງກາຍ. ດັ່ງນັ້ນ, ມັນງ່າຍທີ່ຈະຄາດເດົາວ່າ PNs ທີ່ບໍ່ເຮັດວຽກສາມາດຊົດເຊີຍການບໍລິໂພກຂອງຕົວກາງ TCA ໂດຍອັດຕະໂນມັດທີ່ເກີດຈາກຂະບວນການດູດຊຶມໂດຍການເພີ່ມ atherosclerosis. ໂດຍສະເພາະ, ການເພີ່ມປະລິມານ PCx ອາດຈະຕ້ອງມີເພື່ອຮັກສາຄວາມຕ້ອງການກົດ aspartic ທີ່ເພີ່ມຂຶ້ນ, ເຊິ່ງແນະນຳໃນຈຸລັງທີ່ຂະຫຍາຍຕົວທີ່ມີຄວາມຜິດປົກກະຕິຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍ (45). ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ການວິເຄາະດ້ານການເຜົາຜານອາຫານຂອງພວກເຮົາບໍ່ໄດ້ເປີດເຜີຍການປ່ຽນແປງທີ່ສຳຄັນໃດໆໃນລະດັບສະພາບຄົງທີ່ຂອງກົດ aspartic ໃນ Mfn2cKO PNs (ຮູບ S6A), ເຊິ່ງສົມມຸດວ່າສະທ້ອນເຖິງການນຳໃຊ້ການເຜົາຜານອາຫານທີ່ແຕກຕ່າງກັນຂອງກົດ aspartic ລະຫວ່າງຈຸລັງທີ່ເຕີບໃຫຍ່ ແລະ ເຊວປະສາດຫຼັງໄມໂທຄອນເດຣຍ. ເຖິງແມ່ນວ່າກົນໄກທີ່ແນ່ນອນຂອງການເພີ່ມປະລິມານ PCx ໃນເຊວປະສາດທີ່ບໍ່ເຮັດວຽກໃນຮ່າງກາຍຍັງຄົງຕ້ອງໄດ້ຮັບການກຳນົດລັກສະນະ, ພວກເຮົາໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າການຕອບສະໜອງກ່ອນໄວອັນຄວນນີ້ມີບົດບາດສຳຄັນໃນການຮັກສາສະພາບ redox ຂອງເຊວປະສາດ, ເຊິ່ງໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນໃນການທົດລອງ FLIM ກ່ຽວກັບຊິ້ນສ່ວນ cerebellar. ໂດຍສະເພາະ, ການປ້ອງກັນ PNs ຈາກການເພີ່ມປະລິມານ PCx ສາມາດນຳໄປສູ່ສະພາບທີ່ຜຸພັງຫຼາຍຂຶ້ນ ແລະ ເລັ່ງການຕາຍຂອງເຊວ. ການກະຕຸ້ນການເສື່ອມສະພາບຂອງ BCAA ແລະ carboxylation ຂອງ pyruvate ບໍ່ແມ່ນວິທີທີ່ຈະກຳນົດລັກສະນະເນື້ອເຍື່ອອ້ອມຂ້າງຂອງການເຮັດວຽກຜິດປົກກະຕິຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍ (7). ດັ່ງນັ້ນ, ພວກມັນເບິ່ງຄືວ່າເປັນລັກສະນະສຳຄັນຂອງເຊວປະສາດທີ່ຂາດ OXPHOS, ເຖິງແມ່ນວ່າຈະບໍ່ແມ່ນລັກສະນະດຽວ, ເຊິ່ງມີຄວາມສຳຄັນຕໍ່ການເສື່ອມສະພາບຂອງລະບົບປະສາດກໍຕາມ.
ພະຍາດ cerebellum ເປັນພະຍາດທີ່ເສື່ອມສະພາບຂອງລະບົບປະສາດຊະນິດໜຶ່ງທີ່ມີຄວາມແຕກຕ່າງກັນ ເຊິ່ງມັກຈະສະແດງອອກເປັນ ataxia ແລະມັກຈະທຳລາຍ PNs (46). ກຸ່ມເຊວປະສາດນີ້ມີຄວາມສ່ຽງຕໍ່ການເຮັດວຽກຜິດປົກກະຕິຂອງ mitochondrial ໂດຍສະເພາະ ເພາະວ່າການເສື່ອມສະພາບທີ່ເລືອກເຟັ້ນຂອງພວກມັນໃນໜູພຽງພໍທີ່ຈະສ້າງອາການຫຼາຍຢ່າງຂອງການເຄື່ອນໄຫວທີ່ມີລັກສະນະເປັນ ataxia ຂອງ spinocerebellar ຂອງມະນຸດ (16, 47, 48). ອີງຕາມລາຍງານ, ຮູບແບບໜູ transgenic ທີ່ມີ gene ກາຍພັນແມ່ນກ່ຽວຂ້ອງກັບ ataxia ຂອງ spinocerebellar ຂອງມະນຸດ ແລະມີຄວາມເຮັດວຽກຜິດປົກກະຕິຂອງ mitochondrial (49, 50), ເນັ້ນໜັກເຖິງຄວາມສຳຄັນຂອງການສຶກສາຜົນສະທ້ອນຂອງການຂາດ OXPHOS ໃນ PNPH. ດັ່ງນັ້ນ, ມັນຈຶ່ງເໝາະສົມໂດຍສະເພາະທີ່ຈະແຍກ ແລະສຶກສາກຸ່ມເຊວປະສາດທີ່ເປັນເອກະລັກນີ້ຢ່າງມີປະສິດທິພາບ. ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ເນື່ອງຈາກວ່າ PNs ມີຄວາມອ່ອນໄຫວຫຼາຍຕໍ່ຄວາມກົດດັນ ແລະກວມເອົາສັດສ່ວນຕ່ຳຂອງກຸ່ມເຊວ cerebellum ທັງໝົດ, ສຳລັບການສຶກສາທີ່ອີງໃສ່ omics ຫຼາຍຢ່າງ, ການແຍກພວກມັນເປັນຈຸລັງທັງໝົດແບບເລືອກເຟັ້ນຍັງເປັນລັກສະນະທີ່ທ້າທາຍ. ເຖິງແມ່ນວ່າມັນເກືອບເປັນໄປບໍ່ໄດ້ທີ່ຈະບັນລຸການຂາດການປົນເປື້ອນຢ່າງແທ້ຈິງຂອງຈຸລັງປະເພດອື່ນໆ (ໂດຍສະເພາະເນື້ອເຍື່ອຂອງຜູ້ໃຫຍ່), ພວກເຮົາໄດ້ລວມຂັ້ນຕອນການແຍກຕົວທີ່ມີປະສິດທິພາບກັບ FACS ເພື່ອໃຫ້ໄດ້ຈຳນວນຂອງເຊວປະສາດທີ່ມີຊີວິດຊີວາພຽງພໍສຳລັບການວິເຄາະໂປຣຕີໂອມິກສ໌ຕາມລຳດັບ, ແລະມີການຄອບຄຸມໂປຣຕີນທີ່ຂ້ອນຂ້າງສູງ (ປະມານ 3000 ໂປຣຕີນ) ເມື່ອທຽບກັບຊຸດຂໍ້ມູນທີ່ມີຢູ່ແລ້ວຂອງ cerebellum ທັງໝົດ (51). ໂດຍການຮັກສາຄວາມຢູ່ລອດຂອງຈຸລັງທັງໝົດ, ວິທີການທີ່ພວກເຮົາສະໜອງໃຫ້ຢູ່ທີ່ນີ້ຊ່ວຍໃຫ້ພວກເຮົາບໍ່ພຽງແຕ່ກວດສອບການປ່ຽນແປງໃນເສັ້ນທາງການເຜົາຜານອາຫານໃນ mitochondria ເທົ່ານັ້ນ, ແຕ່ຍັງກວດສອບການປ່ຽນແປງໃນ cytoplasmic ຂອງມັນ, ເຊິ່ງເສີມການໃຊ້ແທັກເຍື່ອ mitochondrial ເພື່ອເສີມປະເພດຈຸລັງ. ວິທີການໃໝ່ສຳລັບຈຳນວນ mitochondria ໃນເນື້ອເຍື່ອທີ່ສັບສົນ (52, 53). ວິທີການທີ່ພວກເຮົາອະທິບາຍບໍ່ພຽງແຕ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບການສຶກສາຂອງຈຸລັງ Purkinje ເທົ່ານັ້ນ, ແຕ່ສາມາດນຳໃຊ້ໄດ້ງ່າຍກັບຈຸລັງປະເພດໃດກໍໄດ້ເພື່ອແກ້ໄຂການປ່ຽນແປງການເຜົາຜານອາຫານໃນສະໝອງທີ່ເປັນພະຍາດ, ລວມທັງຮູບແບບອື່ນໆຂອງການເຮັດວຽກຜິດປົກກະຕິຂອງ mitochondrial.
ສຸດທ້າຍ, ພວກເຮົາໄດ້ກຳນົດໄລຍະເວລາການປິ່ນປົວໃນລະຫວ່າງຂະບວນການຈັດລຽງໂຄງສ້າງການເຜົາຜານອາຫານນີ້ ເຊິ່ງສາມາດປີ້ນກັບອາການສຳຄັນຂອງຄວາມຕຶງຄຽດຂອງເຊວ ແລະ ປ້ອງກັນການເສື່ອມສະພາບຂອງເຊວປະສາດໄດ້ຢ່າງສິ້ນເຊີງ. ດັ່ງນັ້ນ, ການເຂົ້າໃຈຜົນສະທ້ອນທາງດ້ານໜ້າທີ່ຂອງການເຊື່ອມຕໍ່ສາຍໄຟຟ້າທີ່ໄດ້ອະທິບາຍຢູ່ນີ້ອາດຈະໃຫ້ຄວາມເຂົ້າໃຈພື້ນຖານກ່ຽວກັບການປິ່ນປົວທີ່ເປັນໄປໄດ້ສຳລັບການຮັກສາຄວາມຢູ່ລອດຂອງເຊວປະສາດໃນລະຫວ່າງການເຮັດວຽກຜິດປົກກະຕິຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍ. ການຄົ້ນຄວ້າໃນອະນາຄົດທີ່ມີຈຸດປະສົງເພື່ອວິເຄາະການປ່ຽນແປງຂອງການເຜົາຜານພະລັງງານໃນເຊວສະໝອງປະເພດອື່ນໆແມ່ນມີຄວາມຈຳເປັນເພື່ອເປີດເຜີຍຢ່າງເຕັມທີ່ກ່ຽວກັບການນຳໃຊ້ຫຼັກການນີ້ກັບພະຍາດທາງລະບົບປະສາດອື່ນໆ.
ໜູ MitoPark ໄດ້ຖືກອະທິບາຍມາກ່ອນແລ້ວ (31). ໜູ C57BL/6N ທີ່ມີ gene Mfn2 ຢູ່ຂ້າງ loxP ໄດ້ຖືກອະທິບາຍມາກ່ອນແລ້ວ (18) ແລະປະສົມກັບໜູ L7-Cre (23). ລູກຫລານ heterozygous ຄູ່ທີ່ໄດ້ຮັບນັ້ນໄດ້ຖືກປະສົມກັບໜູ homozygous Mfn2loxP/Mfn2loxP ເພື່ອສ້າງ gene knockouts ສະເພາະ Purkinje ສຳລັບ Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). ໃນກຸ່ມຍ່ອຍຂອງການຫາຄູ່, allele Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) ໄດ້ຖືກນຳສະເໜີຜ່ານການປະສົມເພີ່ມເຕີມ (20). ຂັ້ນຕອນການລ້ຽງສັດທັງໝົດໄດ້ຖືກປະຕິບັດຕາມແນວທາງຂອງເອີຣົບ, ລະດັບຊາດ ແລະ ສະຖາບັນ ແລະ ໄດ້ຮັບການອະນຸມັດຈາກ LandesamtfürNatur ຂອງ Umwelt ແລະ Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, ເຢຍລະມັນ. ວຽກງານສັດຍັງປະຕິບັດຕາມຄຳແນະນຳຂອງສະຫະພັນເອີຣົບຂອງສະມາຄົມວິທະຍາສາດສັດຫ້ອງທົດລອງ.
ຫຼັງຈາກໄດ້ໃຫ້ຢາສະລົບແກ່ການເຄື່ອນທີ່ຂອງປາກມົດລູກຂອງແມ່ຍິງຖືພາ, ຕົວອ່ອນໜູຈະຖືກແຍກອອກ (E13). ເປືອກສະໝອງໄດ້ຖືກຜ່າຕັດໃນ Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) ທີ່ເສີມດ້ວຍ 10 mM Hepes ແລະຖ່າຍທອດ Dulbecco's Modified Eagle's Medium ທີ່ມີ papain (20 U/ml) ແລະ cysteine ​​(1μg/ml). ຟັກເນື້ອເຍື່ອໃນ DMEM) ແລະແຍກມັນອອກໂດຍການຍ່ອຍດ້ວຍເອນໄຊມ໌ (ມລ) ທີ່ 37°C ເປັນເວລາ 20 ນາທີ, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນຖືກບົດດ້ວຍກົນຈັກໃນ DMEM ທີ່ເສີມດ້ວຍ 10% fetal bovine serum. ຈຸລັງໄດ້ຖືກຫວ່ານໃສ່ແຜ່ນປິດແກ້ວທີ່ເຄືອບດ້ວຍ polylysine ທີ່ຄວາມໜາແໜ້ນ 2×106 ຕໍ່ຖ້ວຍວັດທະນະທຳ 6 ຊມ ຫຼື ທີ່ຄວາມໜາແໜ້ນ 0.5×105 ຈຸລັງ/ຊມ2 ສຳລັບການວິເຄາະຮູບພາບ. ຫຼັງຈາກ 4 ຊົ່ວໂມງ, ສື່ກາງໄດ້ຖືກປ່ຽນແທນດ້ວຍສື່ກາງທີ່ບໍ່ມີເຊຣັມ Neurobasal ທີ່ມີສານເສີມ B27 1% ແລະ GlutaMax 0.5 mM. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ເຊວປະສາດໄດ້ຖືກຮັກສາໄວ້ທີ່ 37°C ແລະ 5% CO2 ຕະຫຼອດການທົດລອງ, ແລະ ໃຫ້ອາຫານອາທິດລະຄັ້ງ. ເພື່ອກະຕຸ້ນການລວມຕົວກັນໃນຫຼອດທົດລອງ, 3μl (ຈານເພາະເຊື້ອ 24 ຫຼຸມ) ຫຼື 0.5μl (ແຜ່ນ 24 ຫຼຸມ) ຂອງເວັກເຕີໄວຣັສ AAV9 ຕໍ່ໄປນີ້ໄດ້ຖືກນຳໃຊ້ເພື່ອປິ່ນປົວເຊວປະສາດໃນມື້ທີສອງໃນຫຼອດທົດລອງ: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, ເລກລາຍການ 105530-AAV9) ແລະ AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, ເລກລາຍການ 105545-AAV9).
DNA ເສີມ Mfn1 ແລະ Mfn2 ຂອງໜູ (ໄດ້ມາຈາກ plasmid Addgene #23212 ແລະ #23213, ຕາມລຳດັບ) ຖືກໝາຍດ້ວຍລຳດັບ V5 (GKPIPNPLLGLDST) ຢູ່ທີ່ປາຍ C, ແລະຖືກລວມເຂົ້າກັບ mCherry ໃນກອບຜ່ານລຳດັບ T2A. Grx1-roGFP2 ແມ່ນຂອງຂວັນຈາກ Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). ໂດຍການທົດແທນ cassette tdTomato ໂດຍໃຊ້ວິທີການໂຄນແບບທຳມະດາ, cassette ໄດ້ຖືກໂຄນຍ່ອຍເຂົ້າໄປໃນກະດູກສັນຫຼັງ pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (ເລກທີ່ອ້າງອີງ Addgene 28306) ເພື່ອສ້າງເວັກເຕີ pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 ແລະ pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. ຍຸດທະສາດທີ່ຄ້າຍຄືກັນນີ້ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອສ້າງເວັກເຕີຄວບຄຸມ pAAV-CAG-FLEX-mCherry. ເພື່ອສ້າງໂຄງສ້າງ AAV-shPCx, ຕ້ອງມີເວັກເຕີ plasmid AAV (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) ເຊິ່ງປະກອບດ້ວຍລໍາດັບ DNA ທີ່ເຂົ້າລະຫັດ shRNA ເປົ້າໝາຍໜູ PCx (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) ພາຍໃຕ້ການຄວບຄຸມຂອງໂປຣໂມເຕີ U6, mCherry ຖືກນໍາໃຊ້ພາຍໃຕ້ການຄວບຄຸມຂອງໂປຣໂມເຕີ CMV. ການຜະລິດເວັກເຕີ AAV ຊ່ວຍໄດ້ຖືກປະຕິບັດຕາມຄໍາແນະນໍາຂອງຜູ້ຜະລິດ (Cell Biolabs). ສະຫຼຸບແລ້ວ, ໃຫ້ໃຊ້ພລາສມິດທີ່ໂອນຍ້າຍທີ່ມີ mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ຊົ່ວຄາວ ການໂອນຍ້າຍຈຸລັງ 293AAV-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ຫຼື Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2), ເຊັ່ນດຽວກັນກັບການເຂົ້າລະຫັດໂປຣຕີນ capsid AAV1 ແລະພລາສມິດຫຸ້ມຫໍ່ໂປຣຕີນເສີມ, ໂດຍໃຊ້ວິທີການແຄວຊຽມຟອສເຟດ. ນ້ຳເຊື້ອໄວຣັດດິບໄດ້ມາຈາກວົງຈອນການແຊ່ແຂງ-ລະລາຍໃນອ່າງນ້ຳກ້ອນແຫ້ງ/ເອທານອນ ແລະ ຈຸລັງທີ່ຖືກລະລາຍໃນນ້ຳເຄັມຟອສເຟດ (PBS). ເວັກເຕີ AAV ໄດ້ຖືກບໍລິສຸດໂດຍການປັ່ນ iodixanol gradient ultracentrifugation ທີ່ບໍ່ຕໍ່ເນື່ອງ (24 ຊົ່ວໂມງທີ່ 32,000 rpm ແລະ 4°C) ແລະ ເຂັ້ມຂຸ້ນໂດຍໃຊ້ຕົວກອງ centrifugal Amicon ultra-15. titer genome ຂອງ AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 ສຳເນົາຈີໂນມ (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX ແມ່ນດັ່ງທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ກ່ອນໜ້ານີ້ (54), ວັດແທກໂດຍ PCR ປະລິມານເວລາຈິງ (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) ແລະ AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml).
ເຊວປະສາດຂັ້ນຕົ້ນໄດ້ຖືກຂູດອອກໃນນ້ຳກ້ອນ 1x PBS, ປັ້ນເປັນເມັດ, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນເຮັດໃຫ້ເປັນເອກະພາບໃນ 0.5% Triton X-100 / 0.5% sodium deoxycholate/PBS lysis buffer ທີ່ມີ phosphatase ແລະ protease inhibitor (Roche). ການວັດແທກປະລິມານໂປຣຕີນໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍການໃຊ້ການວິເຄາະກົດ bicinchoninic (Thermo Fisher Scientific). ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ໂປຣຕີນໄດ້ຖືກແຍກອອກໂດຍ SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນຖືກ blot ໃສ່ເຍື່ອ polyvinylidene fluoride (GE Healthcare). ບລັອກບໍລິເວນທີ່ບໍ່ສະເພາະເຈາະຈົງ ແລະ ບົ່ມເຊື້ອດ້ວຍພູມຕ້ານທານຂັ້ນຕົ້ນ (ເບິ່ງຕາຕະລາງ S1 ສຳລັບລາຍລະອຽດ) ໃນນົມ 5% ໃນ TBST (Tris-buffered saline with Tween), ຂັ້ນຕອນການລ້າງ ແລະ ພູມຕ້ານທານຂັ້ນສອງໃນ TBST Incubate. ບົ່ມເຊື້ອດ້ວຍພູມຕ້ານທານຂັ້ນຕົ້ນຄ້າງຄືນທີ່ +4°C. ຫຼັງຈາກລ້າງແລ້ວ, ໃຫ້ໃຊ້ພູມຕ້ານທານຂັ້ນສອງເປັນເວລາ 2 ຊົ່ວໂມງທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງ. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ໂດຍການບົ່ມເຊື້ອ blot ດຽວກັນດ້ວຍພູມຕ້ານທານຕ້ານ β-actin, ການໂຫຼດດຽວກັນໄດ້ຮັບການຢືນຢັນ. ການກວດພົບໂດຍການປ່ຽນໄປເປັນ chemiluminescence ແລະ ເສີມຂະຫຍາຍ chemiluminescence (GE Healthcare).
ເຊວປະສາດທີ່ເຄີຍຖືກຫວ່ານຢູ່ໃນແຜ່ນປິດແກ້ວໄດ້ຖືກແກ້ໄຂດ້ວຍ 4% paraformaldehyde (PFA)/PBS ໃນຈຸດເວລາທີ່ກຳນົດໄວ້ທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງເປັນເວລາ 10 ນາທີ. ແຜ່ນປິດຈະຖືກແຊກຊຶມດ້ວຍ 0.1% Triton X-100/PBS ເປັນເວລາ 5 ນາທີທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງ, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນໃນ blocking buffer [3% bovine serum albumin (BSA)/PBS]. ໃນມື້ທີສອງ, ແຜ່ນປິດໄດ້ຖືກລ້າງດ້ວຍ buffer blocking ແລະ ບົ່ມດ້ວຍພູມຕ້ານທານທີສອງທີ່ເຊື່ອມຕໍ່ fluorophore ທີ່ເໝາະສົມເປັນເວລາ 2 ຊົ່ວໂມງທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງ; ສຸດທ້າຍ, ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກລ້າງຢ່າງລະອຽດໃນ PBS ດ້ວຍ 4′,6-diamidino-2-Phenylindole (DAPI) ແລະ ຍ້ອມສີຕ້ານການຍ້ອມສີ ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນຕິດຢູ່ເທິງແຜ່ນສະໄລ້ກ້ອງຈຸລະທັດດ້ວຍ Aqua-Poly/Mount.
ໜູ (ເພດຜູ້ ແລະ ເພດແມ່) ໄດ້ຮັບຢາສະລົບໂດຍການສັກ ketamine (130 ມກ/ກກ) ແລະ xylazine (10 ມກ/ກກ) ເຂົ້າຊ່ອງທ້ອງ ແລະ ໃຫ້ຢາແກ້ປວດ carprofen (5 ມກ/ກກ) ພາຍໃຕ້ຜິວໜັງ, ແລະ ວາງໄວ້ໃນເຄື່ອງມື stereotactic (Kopf) ທີ່ມີຜ້າອຸ່ນ. ເປີດກະໂຫຼກຫົວອອກ ແລະ ໃຊ້ເຄື່ອງເຈາະແຂ້ວເພື່ອເຮັດໃຫ້ສ່ວນຂອງ cerebellum ທີ່ສອດຄ້ອງກັບກະດູກ mis ບາງລົງ (ຈາກ lambda: ຫາງ 1.8, ຂ້າງ 1, ສອດຄ້ອງກັບ lobules IV ແລະ V). ໃຊ້ເຂັມສັກຢາໂຄ້ງເພື່ອສ້າງຮູນ້ອຍໆໃນກະໂຫຼກຫົວຢ່າງລະມັດລະວັງເພື່ອຫຼີກເວັ້ນການລົບກວນເສັ້ນເລືອດຂ້າງລຸ່ມ. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, capillary ແກ້ວທີ່ດຶງບາງໆຈະຖືກສຽບເຂົ້າໄປໃນຮູນ້ອຍໆຊ້າໆ (ຈາກ -1.3 ຫາ -1 ຢູ່ດ້ານຂ້າງຂອງ dura mater), ແລະ 200 ຫາ 300 nl AAV ຖືກສັກເຂົ້າໄປໃນເຄື່ອງສັກຢາຈຸລະພາກ (Narishige) ດ້ວຍເຂັມສັກຢາຄູ່ມື (Narishige) ຫຼາຍຄັ້ງທີ່ຄວາມດັນຕ່ຳໃນໄລຍະເວລາ 10 ຫາ 20 ນາທີ. ຫຼັງຈາກການສີດນ້ຳແລ້ວ, ໃຫ້ວາງເສັ້ນເລືອດຝອຍໄວ້ອີກ 10 ນາທີ ເພື່ອໃຫ້ໄວຣັດແຜ່ລາມໄດ້ຢ່າງສົມບູນ. ຫຼັງຈາກເສັ້ນເລືອດຝອຍຖືກດຶງອອກແລ້ວ, ຜິວໜັງຈະຖືກຫຍິບຢ່າງລະມັດລະວັງເພື່ອຫຼຸດຜ່ອນການອັກເສບຂອງບາດແຜ ແລະ ໃຫ້ສັດຟື້ນຕົວ. ສັດໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍຢາແກ້ປວດ (caspofen) ເປັນເວລາຫຼາຍມື້ຫຼັງຈາກການຜ່າຕັດ, ໃນລະຫວ່າງນັ້ນສະພາບຮ່າງກາຍຂອງພວກມັນໄດ້ຖືກຕິດຕາມກວດກາຢ່າງລະມັດລະວັງ ແລະ ຫຼັງຈາກນັ້ນພວກມັນໄດ້ຖືກຂ້າໃນຈຸດເວລາທີ່ກຳນົດໄວ້. ຂັ້ນຕອນທັງໝົດໄດ້ດຳເນີນການຕາມແນວທາງຂອງເອີຣົບ, ລະດັບຊາດ ແລະ ສະຖາບັນ ແລະ ໄດ້ຮັບການອະນຸມັດຈາກ LandesamtfürNatur ຂອງ Umwelt ແລະ Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, ເຢຍລະມັນ.
ສັດໄດ້ຮັບການໃຫ້ຢາສະລົບດ້ວຍ ketamine (100 mg/kg) ແລະ xylazine (10 mg/kg), ແລະຫົວໃຈໄດ້ຖືກສີດດ້ວຍ 0.1 M PBS ກ່ອນ, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນດ້ວຍ 4% PFA ໃນ PBS. ເນື້ອເຍື່ອໄດ້ຖືກຜ່າຕັດ ແລະ ຄົງທີ່ໃນ 4% PFA/PBS ຄ້າງຄືນທີ່ອຸນຫະພູມ 4°C. ມີດສັ່ນ (Leica Microsystems GmbH, Vienna, Austria) ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອກະກຽມພາກສ່ວນ sagittal (ໜາ 50 μm) ຈາກສະໝອງຄົງທີ່ໃນ PBS. ເວັ້ນເສຍແຕ່ຈະມີການລະບຸໄວ້ເປັນຢ່າງອື່ນ, ການຍ້ອມສີຂອງພາກສ່ວນທີ່ລອຍຕົວໄດ້ປະຕິບັດຕາມທີ່ໄດ້ອະທິບາຍຂ້າງເທິງ (13) ທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງ ແລະ ຄົນໃຫ້ເຂົ້າກັນ. ໂດຍຫຍໍ້, ກ່ອນອື່ນໝົດ, ຊິ້ນສ່ວນທີ່ໄດ້ຮັບໄດ້ຖືກສີດດ້ວຍ 0.5% Triton X-100/PBS ເປັນເວລາ 15 ນາທີທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງ; ສໍາລັບ epitopes ບາງຊະນິດ (Pcx ແລະ Shmt2), ໂດຍໃນ buffer tris-EDTA ທີ່ອຸນຫະພູມ 80°C (PH 9) ໃຫ້ຄວາມຮ້ອນຊິ້ນສ່ວນເປັນເວລາ 25 ນາທີແທນທີ່ຈະເປັນຂັ້ນຕອນນີ້. ຕໍ່ໄປ, ພາກສ່ວນຕ່າງໆໄດ້ຖືກບົ່ມເຊື້ອດ້ວຍພູມຕ້ານທານຂັ້ນຕົ້ນ (ເບິ່ງຕາຕະລາງ S1) ໃນ buffer blocking (3% BSA/PBS) ທີ່ 4°C ຄ້າງຄືນພ້ອມກັບການຄົນ. ມື້ຕໍ່ມາ, ພາກສ່ວນຕ່າງໆໄດ້ຖືກລ້າງດ້ວຍ buffer blocking ແລະບົ່ມເຊື້ອດ້ວຍພູມຕ້ານທານຂັ້ນສອງທີ່ເຂົ້າກັບ fluorophore ທີ່ເໝາະສົມເປັນເວລາ 2 ຊົ່ວໂມງທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງ; ສຸດທ້າຍ, ພາກສ່ວນຕ່າງໆໄດ້ຖືກລ້າງຢ່າງລະອຽດໃນ PBS, ຍ້ອມສີຕ້ານການປົນເປື້ອນດ້ວຍ DAPI, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນແກ້ໄຂດ້ວຍ AquaPolymount ໃນແຜ່ນສະໄລ້ກ້ອງຈຸລະທັດ.
ກ້ອງຈຸລະທັດຄອນໂຟກັສສະແກນເລເຊີ (TCS SP8-X ຫຼື TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) ທີ່ມີເລເຊີແສງສີຂາວ ແລະ ເລເຊີ ultraviolet 405 diode ໄດ້ຖືກນຳໃຊ້ເພື່ອຖ່າຍພາບຕົວຢ່າງ. ໂດຍການຕື່ນເຕັ້ນກັບ fluorophore ແລະ ເກັບກຳສັນຍານດ້ວຍ Hybrid Detector (HyDs), ຊອບແວ LAS-X ໄດ້ຖືກນຳໃຊ້ເພື່ອເກັບກຳຮູບພາບທີ່ຊ້ອນກັນທີ່ສອດຄ່ອງກັບການເກັບກຳ Nyquist ໃນຮູບແບບລຳດັບ: ສຳລັບແຜງທີ່ບໍ່ແມ່ນປະລິມານ, ມັນແມ່ນສັນຍານທີ່ມີການເຄື່ອນໄຫວສູງ (ຕົວຢ່າງ, ໃນຈຸລັງ somatic ແລະ dendrites) mtYFP) ໃຊ້ HyD ເພື່ອກວດຫາຈຳນວນ PNs ໃນໂໝດ BrightR). Gating ຈາກ 0.3 ຫາ 6 ns ຖືກນຳໃຊ້ເພື່ອຫຼຸດຜ່ອນພື້ນຫຼັງ.
ການຖ່າຍພາບແບບເວລາຈິງຂອງຈຸລັງທີ່ຖືກຈັດລຽງແລ້ວ. ຫຼັງຈາກການຈັດລຽງໃນສື່ກາງ Neurobasal-A ທີ່ມີອາຫານເສີມ B27 1% ແລະ GlutaMax 0.5 mM, ຈຸລັງໄດ້ຖືກຫວ່ານລົງໃນແຜ່ນສະໄລ້ແກ້ວເຄືອບ poly-l-lysine ທັນທີ (μ-Slide8 Well, Ibidi, ໝາຍເລກລາຍການ 80826), ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນເກັບຮັກສາໄວ້ທີ່ 37°C ແລະ 5% CO2 ເປັນເວລາ 1 ຊົ່ວໂມງເພື່ອໃຫ້ຈຸລັງຕົກລົງ. ການຖ່າຍພາບແບບເວລາຈິງໄດ້ຖືກປະຕິບັດໃນກ້ອງຈຸລະທັດ confocal ສະແກນເລເຊີ Leica SP8 ທີ່ມີເລເຊີສີຂາວ, HyD, ເລນວັດຖຸນ້ຳມັນ 63×[1.4 ຮູຮັບແສງຕົວເລກ (NA)] ແລະ ເວທີຄວາມຮ້ອນ.
ໜູໄດ້ຖືກໃຫ້ຢາສະລົບຢ່າງໄວວາດ້ວຍຄາບອນໄດອອກໄຊ ແລະ ຕັດຫົວ, ສະໝອງໄດ້ຖືກເອົາອອກຈາກກະໂຫຼກຢ່າງໄວວາ, ແລະ ຕັດເປັນພາກສ່ວນ sagittal ໜາ 200μm (ສຳລັບການທົດລອງການຕິດສະຫຼາກ 13C) ຫຼື ໜາ 275μm (ສຳລັບການທົດລອງໂຟຕອນສອງຄັ້ງ) ທີ່ເຕັມໄປດ້ວຍວັດສະດຸຕໍ່ໄປນີ້. ກະແລ້ມ (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, ເຢຍລະມັນ) ແມ່ນເຕັມໄປດ້ວຍສານຕໍ່ໄປນີ້: NaCl ນ້ຳກ້ອນເຢັນ 125 mM, ອີ່ມຕົວດ້ວຍຄາບອນ (95% O2 ແລະ 5% CO2) Ca2 ຕ່ຳ + ນ້ຳไขสันหลังທຽມ (ACSF), NaCl 2.5 mM KCl, ບັຟເຟີໂຊດຽມຟອສເຟດ 1.25 mM, NaHCO3 25 mM, ນ້ຳຕານກລູໂຄສ 25 mM, CaCl2 0.5 mM ແລະ MgCl2 3.5 mM (ຄວາມດັນ osmotic 310 ຫາ 330 mmol). ຍ້າຍຊິ້ນສ່ວນສະໝອງທີ່ໄດ້ຮັບໄປຫ້ອງຟັກກ່ອນທີ່ມີ Ca2 + ACSF ສູງ (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM ໂຊດຽມຟອສເຟດບັຟເຟີ, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 ແລະ 2.0 mM MgCl2) ປານກາງ) pH 7.4 ແລະ 310 ຫາ 320 mmol).
ໃນລະຫວ່າງຂະບວນການຖ່າຍພາບ, ຊິ້ນສ່ວນຕ່າງໆໄດ້ຖືກຍ້າຍໄປຢູ່ໃນຫ້ອງຖ່າຍພາບສະເພາະ, ແລະການທົດລອງໄດ້ດຳເນີນພາຍໃຕ້ການສີດ ACSF ຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງທີ່ອຸນຫະພູມຄົງທີ່ 32° ຫາ 33°C. ກ້ອງຈຸລະທັດສະແກນເລເຊີຫຼາຍໂຟຕອນ (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) ທີ່ມີເລນວັດຖຸ Leica 25x (NA 0.95, ນ້ຳ), ເລເຊີ Ti:Sapphire (Chameleon Vision II, Coherent) ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການຖ່າຍພາບຊິ້ນສ່ວນ. ໂມດູນ FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM ຂອງ Grx1-roGFP2. ການປ່ຽນແປງໃນສະຖານະການ redox ຂອງ cytoplasm ຂອງ PNs ໄດ້ຖືກວັດແທກໂດຍ FLIM ສອງໂຟຕອນໃນຊິ້ນສ່ວນສະໝອງ sagittal, ບ່ອນທີ່ biosensor Grx1-roGFP2 ແນໃສ່ PNs. ໃນຊັ້ນ PN, ພາກສະໜາມການໄດ້ຮັບຖືກເລືອກປະມານ 50 ຫາ 80 μm ຢູ່ລຸ່ມໜ້າດິນຂອງຊິ້ນສ່ວນເພື່ອຮັບປະກັນວ່າມີ PN ທີ່ມີຊີວິດຊີວາ (ນັ້ນຄື, ການຂາດໂຄງສ້າງລູກປັດ ຫຼື ການປ່ຽນແປງຮູບຮ່າງຂອງເສັ້ນປະສາດຕາມ dendrites) ແລະເຊັນເຊີ roGFP2 ສອງບວກ ແລະ AAV ທີ່ເຂົ້າລະຫັດ shRNA PCx ຫຼື ລຳດັບການຄວບຄຸມຂອງມັນ (ແຕ່ລະອັນສະແດງຮ່ວມກັນ mCherry). ເກັບກຳຮູບພາບ single-stack ດ້ວຍການຊູມດິຈິຕອລ 2x [ຄວາມຍາວຄື້ນກະຕຸ້ນ: 890 nm; 512 nm 512 ພິກເຊວ]. ການກວດຈັບ: HyD ພາຍໃນ, ກຸ່ມຕົວກອງ fluorescein isothiocyanate (FITC)] ແລະ ການວິເຄາະຮູບພາບສະເລ່ຍພາຍໃນ 2 ຫາ 3 ນາທີແມ່ນໃຊ້ເພື່ອຮັບປະກັນວ່າມີການເກັບກຳໂຟຕອນພຽງພໍ (ທັງໝົດ 1000 ໂຟຕອນ) ສຳລັບການປັບເສັ້ນໂຄ້ງ. ຄວາມອ່ອນໄຫວຂອງໂພຣບ Grx1-roGFP2 ແລະການກວດສອບເງື່ອນໄຂ FLIM ໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍການຕິດຕາມຄ່າອາຍຸການໃຊ້ງານຂອງ roGFP2 ເມື່ອເພີ່ມ 10 mM H2O2 ຈາກພາຍນອກໃສ່ ACSF ຂອງການໄຫຼວຽນຂອງເລືອດ (ເພື່ອເພີ່ມການຜຸພັງໃຫ້ສູງສຸດ, ເຊິ່ງເຮັດໃຫ້ອາຍຸການໃຊ້ງານເພີ່ມຂຶ້ນ), ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນເພີ່ມ 2 mM dithiothreitol (ຫຼຸດລະດັບການຫຼຸດຜ່ອນ, ເຊິ່ງເຮັດໃຫ້ອາຍຸການໃຊ້ງານຫຼຸດລົງ) (ຮູບ S8, D ຫາ G). ໃຊ້ຊອບແວ FLIMfit 5.1.1 ເພື່ອວິເຄາະຜົນໄດ້ຮັບທີ່ໄດ້ມາ, ປັບເສັ້ນໂຄ້ງການເສື່ອມໂຊມແບບ exponential ດຽວຂອງຮູບພາບທັງໝົດໃຫ້ເໝາະສົມກັບ IRF ທີ່ວັດແທກໄດ້ (ໜ້າທີ່ຕອບສະໜອງຂອງເຄື່ອງມື), ແລະ χ2 ແມ່ນປະມານ 1. ເພື່ອຄິດໄລ່ອາຍຸການໃຊ້ງານຂອງ PN ດຽວ, ໜ້າກາກອ້ອມຮອບຮ່າງກາຍຂອງເສັ້ນປະສາດໄດ້ຖືກແຕ້ມດ້ວຍມື, ແລະອາຍຸການໃຊ້ງານສະເລ່ຍໃນແຕ່ລະໜ້າກາກໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການວັດແທກ.
ການວິເຄາະທ່າແຮງຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍ. ຫຼັງຈາກພາກສ່ວນສ້ວຍແຫຼມຖືກບົ່ມດ້ວຍ TMRM 100 nM ທີ່ເພີ່ມໂດຍກົງໃສ່ ACSF ທີ່ຖືກ perfused ເປັນເວລາ 30 ນາທີ, ການປ່ຽນແປງທ່າແຮງຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍຂອງ PNs ໄດ້ຖືກວັດແທກໂດຍກ້ອງຈຸລະທັດສອງໂຟຕອນ. ການຖ່າຍພາບ TMRM ໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍການກະຕຸ້ນໂພຣບທີ່ 920 nm ແລະການໃຊ້ HyD ພາຍໃນ (tetramethylrhodamine isothiocyanate: 585/40 nm) ເພື່ອເກັບກຳສັນຍານ; ໂດຍການໃຊ້ຄວາມຍາວຄື້ນກະຕຸ້ນດຽວກັນແຕ່ໃຊ້ HyD ພາຍໃນທີ່ແຕກຕ່າງກັນ (FITC: 525/50) ເພື່ອຖ່າຍພາບ mtYFP. ໃຊ້ປລັກອິນ Image Calculator ຂອງ ImageJ ເພື່ອປະເມີນທ່າແຮງຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍໃນລະດັບເຊວດຽວ. ສະຫຼຸບແລ້ວ, ສົມຜົນປລັກອິນ: ສັນຍານ = min (mtYFP, TMRM) ຖືກໃຊ້ເພື່ອລະບຸພາກພື້ນໄມໂທຄອນເດຣຍທີ່ສະແດງສັນຍານ TMRM ໃນ Purkinje Somali ໃນຮູບພາບ confocal ຊັ້ນດຽວຂອງຊ່ອງທາງທີ່ສອດຄ້ອງກັນ. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ພື້ນທີ່ພິກເຊວໃນໜ້າກາກທີ່ໄດ້ຮັບຈະຖືກວັດແທກ, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນຖືກປັບໃຫ້ເປັນປົກກະຕິໃນຮູບພາບ threshold single-stack ທີ່ສອດຄ້ອງກັນຂອງຊ່ອງທາງ mtYFP ເພື່ອໃຫ້ໄດ້ສ່ວນ mitochondrial ທີ່ສະແດງໃຫ້ເຫັນທ່າແຮງຂອງ mitochondrial.
ຮູບພາບໄດ້ຖືກແຍກສ່ວນອອກດ້ວຍຊອບແວ Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). ສຳລັບຮູບພາບທີ່ສະແກນຂອງກະເບື້ອງ, ການຕັດຕໍ່ຂອງກະເບື້ອງດຽວແມ່ນເຮັດໂດຍໃຊ້ອັລກໍຣິທຶມການຕໍ່ອັດຕະໂນມັດທີ່ສະໜອງໃຫ້ໂດຍຊອບແວ LAS-X. ຫຼັງຈາກການປັບທຽບຮູບພາບ, ໃຫ້ໃຊ້ ImageJ ແລະ Adobe Photoshop ເພື່ອປະມວນຜົນຮູບພາບຕື່ມອີກ ແລະ ປັບຄວາມສະຫວ່າງ ແລະ ຄວາມຄົມຊັດຢ່າງເປັນເອກະພາບ. ໃຊ້ Adobe Illustrator ສຳລັບການກະກຽມກຣາບຟິກ.
ການວິເຄາະຈຸດສຸມ mtDNA. ຈຳນວນຂອງຮອຍແຜ mtDNA ໄດ້ຖືກວັດແທກຢູ່ໃນພາກສ່ວນ cerebellar ທີ່ມີປ້າຍກຳກັບດ້ວຍພູມຕ້ານທານຕໍ່ DNA ໂດຍກ້ອງຈຸລະທັດ confocal. ແຕ່ລະພື້ນທີ່ເປົ້າໝາຍໄດ້ຖືກສ້າງຂຶ້ນສຳລັບຮ່າງກາຍຂອງຈຸລັງ ແລະ ນິວເຄຼຍສ໌ຂອງແຕ່ລະຈຸລັງ, ແລະ ພື້ນທີ່ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ໂດຍໃຊ້ປລັກອິນ Multi Measure (ຊອບແວ ImageJ). ລົບພື້ນທີ່ນິວເຄຼຍສ໌ອອກຈາກພື້ນທີ່ຮ່າງກາຍຂອງຈຸລັງເພື່ອໃຫ້ໄດ້ພື້ນທີ່ cytoplasmic. ສຸດທ້າຍ, ປລັກອິນ Analyze Particles (ຊອບແວ ImageJ) ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອວັດແທກຈຸດ DNA cytoplasmic ໂດຍອັດຕະໂນມັດທີ່ຊີ້ບອກ mtDNA ໃນຮູບພາບ threshold, ແລະ ຜົນໄດ້ຮັບທີ່ໄດ້ຮັບໄດ້ຖືກປັບໃຫ້ເປັນປົກກະຕິກັບຄ່າສະເລ່ຍ PN ຂອງໜູ CTRL. ຜົນໄດ້ຮັບແມ່ນສະແດງເປັນຈຳນວນສະເລ່ຍຂອງ nucleosides ຕໍ່ຈຸລັງ.
ການວິເຄາະການສະແດງອອກຂອງໂປຣຕີນ. ໃຊ້ປລັກອິນ Image Calculator ຂອງ ImageJ ເພື່ອປະເມີນການສະແດງອອກຂອງໂປຣຕີນໃນ PN ໃນລະດັບເຊວດຽວ. ສະຫຼຸບແລ້ວ, ໃນຮູບພາບ confocal ຊັ້ນດຽວຂອງຊ່ອງທາງທີ່ສອດຄ້ອງກັນ, ຜ່ານສົມຜົນ: ສັນຍານ = min (mtYFP, ພູມຕ້ານທານ), ພາກພື້ນໄມໂທຄອນເດຣຍທີ່ສະແດງຄວາມເຄື່ອນໄຫວຂອງພູມຕ້ານທານຕໍ່ກັບພູມຕ້ານທານສະເພາະໃນ Purkina ຈະຖືກລະບຸ. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ພື້ນທີ່ພິກເຊວໃນໜ້າກາກທີ່ໄດ້ຮັບຈະຖືກວັດແທກ, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນຖືກປັບໃຫ້ເປັນປົກກະຕິໃນຮູບພາບຊັ້ນດຽວຂອງຊ່ອງທາງ mtYFP ເພື່ອໃຫ້ໄດ້ສ່ວນໄມໂທຄອນເດຣຍຂອງໂປຣຕີນທີ່ສະແດງ.
ການວິເຄາະຄວາມໜາແໜ້ນຂອງຈຸລັງ Purkinje. ປລັກອິນ Cell Counter ຂອງ ImageJ ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອປະເມີນຄວາມໜາແໜ້ນຂອງ Purkinje ໂດຍການຫານຈໍານວນຈຸລັງ Purkinje ທີ່ນັບໄດ້ດ້ວຍຄວາມຍາວຂອງວົງແຫວນ cerebellar ທີ່ຈຸລັງທີ່ຖືກນັບໄດ້ຄອບຄອງ.
ການກະກຽມຕົວຢ່າງ ແລະ ການເກັບຕົວຢ່າງ. ສະໝອງຈາກກຸ່ມຄວບຄຸມ ແລະ ໜູ Mfn2cKO ໄດ້ຖືກຕິດຢູ່ໃນ 2% PFA/2.5% glutaraldehyde ໃນບັຟເຟີຟອສເຟດ 0.1 M (PB), ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນ ພາກສ່ວນ coronal ໄດ້ຖືກກະກຽມໂດຍໃຊ້ ciliates (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) (ຄວາມໜາ 50 ຫາ 60 μm). ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ຕິດຢູ່ໃນບັຟເຟີ PB ໃນ 1% os tetraoxide ແລະ 1.5% potassium ferrocyanide ທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງເປັນເວລາ 1 ຊົ່ວໂມງ. ພາກສ່ວນຕ່າງໆໄດ້ຖືກລ້າງສາມຄັ້ງດ້ວຍນ້ຳກັ່ນ, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນຍ້ອມສີດ້ວຍເອທານອນ 70% ທີ່ມີ 1% uranyl acetate ເປັນເວລາ 20 ນາທີ. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ພາກສ່ວນຕ່າງໆໄດ້ຖືກເຮັດໃຫ້ແຫ້ງໃນເຫຼົ້າທີ່ມີລະດັບ ແລະ ຝັງຢູ່ໃນ Durcupan ACM (Araldite casting resin M) epoxy resin (Electron Microscopy Sciences, ໝາຍເລກລາຍການ 14040) ລະຫວ່າງແຜ່ນແກ້ວທີ່ເຄືອບດ້ວຍຊິລິໂຄນ, ແລະສຸດທ້າຍທີ່ 60°C ປະສົມໂພລີເມີໃນເຕົາອົບເປັນເວລາ 48 ຊົ່ວໂມງ. ພື້ນທີ່ເປືອກສະໝອງນ້ອຍໄດ້ຖືກເລືອກ ແລະ ພາກສ່ວນບາງໆ 50 nm ໄດ້ຖືກຕັດດ້ວຍ Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) ແລະ ຕັດໃສ່ຕາຂ່າຍທອງແດງຂະໜາດ 2×1 ມມ ທີ່ເຄືອບດ້ວຍຟິມ polystyrene. ພາກສ່ວນດັ່ງກ່າວໄດ້ຖືກຍ້ອມສີດ້ວຍສານລະລາຍ uranyl acetate 4% ໃນນ້ຳ H2O ເປັນເວລາ 10 ນາທີ, ລ້າງດ້ວຍນ້ຳ H2O ຫຼາຍຄັ້ງ, ຈາກນັ້ນດ້ວຍ Reynolds lead citrate ໃນນ້ຳ H2O ເປັນເວລາ 10 ນາທີ, ແລະ ຫຼັງຈາກນັ້ນລ້າງດ້ວຍນ້ຳ H2O ຫຼາຍຄັ້ງ. ຮູບຖ່າຍຈຸລະພາກໄດ້ຖືກຖ່າຍດ້ວຍກ້ອງຈຸລະທັດອີເລັກຕຣອນສົ່ງຜ່ານ Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ໂດຍໃຊ້ກ້ອງດິຈິຕອລ TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, USA). ເຢຍລະມັນ).
ສຳລັບໜູທີ່ຕິດເຊື້ອ AAV, ສະໝອງໄດ້ຖືກແຍກອອກ ແລະ ຕັດເປັນພາກສ່ວນ sagittal ໜາ 1 ມມ, ແລະ cerebellum ໄດ້ຖືກກວດສອບໂດຍໃຊ້ກ້ອງຈຸລະທັດ fluorescence ເພື່ອລະບຸວົງແຫວນທີ່ຕິດເຊື້ອ AAV (ນັ້ນຄື mCherry expressing). ມີພຽງການທົດລອງທີ່ການສັກ AAV ເຮັດໃຫ້ມີປະສິດທິພາບການສົ່ງສັນຍານສູງຫຼາຍຂອງຊັ້ນເຊວ Purkinje (ໝາຍຄວາມວ່າເກືອບທັງໝົດຊັ້ນ) ໃນວົງແຫວນ cerebellar ຢ່າງໜ້ອຍສອງວົງຕິດຕໍ່ກັນເທົ່ານັ້ນທີ່ຖືກນຳໃຊ້. ວົງແຫວນທີ່ສົ່ງສັນຍານ AAV ໄດ້ຖືກຜ່າຕັດຂະໜາດນ້ອຍເພື່ອການຕິດຄ້າງຄືນ (4% PFA ແລະ 2.5% glutaraldehyde ໃນບັຟເຟີ cocoate 0.1 M) ແລະ ປຸງແຕ່ງຕື່ມອີກ. ສຳລັບການຝັງ EPON, ເນື້ອເຍື່ອທີ່ຄົງທີ່ໄດ້ຖືກລ້າງດ້ວຍບັຟເຟີ sodium cocoate 0.1 M (Applichem), ແລະ ບົ່ມດ້ວຍ 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) ໃນບັຟເຟີ sodium cocoate 0.1 M (Applichem) 4 ຊົ່ວໂມງ, ຈາກນັ້ນລ້າງເປັນເວລາ 2 ຊົ່ວໂມງ. ເຮັດຊ້ຳອີກ 3 ຄັ້ງດ້ວຍບັຟເຟີ cocamide 0.1 M. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ຊຸດເອທານອນທີ່ເພີ່ມຂຶ້ນໄດ້ຖືກນຳໃຊ້ເພື່ອບົ່ມສານລະລາຍເອທານອນແຕ່ລະຊະນິດທີ່ອຸນຫະພູມ 4°C ເປັນເວລາ 15 ນາທີເພື່ອເຮັດໃຫ້ເນື້ອເຍື່ອແຫ້ງ. ເນື້ອເຍື່ອໄດ້ຖືກໂອນໄປຫາໂພຣພີລີນອອກໄຊ ແລະ ບົ່ມຄ້າງຄືນໃນ EPON (Sigma-Aldrich) ທີ່ອຸນຫະພູມ 4°C. ວາງເນື້ອເຍື່ອໃນ EPON ສົດທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງເປັນເວລາ 2 ຊົ່ວໂມງ, ແລະ ຈາກນັ້ນຝັງມັນທີ່ອຸນຫະພູມ 62°C ເປັນເວລາ 72 ຊົ່ວໂມງ. ໃຊ້ເຄື່ອງ ultramicrotome (Leica Microsystems, UC6) ແລະ ມີດເພັດ (Diatome, Biel, ສະວິດເຊີແລນ) ເພື່ອຕັດສ່ວນບາງໆ 70 nm, ແລະ ຍ້ອມສີດ້ວຍ uranyl acetate 1.5% ເປັນເວລາ 15 ນາທີທີ່ອຸນຫະພູມ 37°C, ແລະ ຍ້ອມສີດ້ວຍສານລະລາຍ lead citrate ເປັນເວລາ 4 ນາທີ. ຮູບຖ່າຍຈຸລະພາກເອເລັກຕຣອນໄດ້ຖືກຖ່າຍໂດຍໃຊ້ກ້ອງຈຸລະທັດເອເລັກຕຣອນສົ່ງຜ່ານ JEM-2100 Plus (JEOL) ທີ່ມີຊອບແວ Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) ແລະ DigitalMicrograph (Gatan). ສຳລັບການວິເຄາະ, ຮູບຖ່າຍຈຸລະພາກອີເລັກຕຣອນໄດ້ຖືກເກັບມາດ້ວຍການຊູມດິຈິຕອລ 5000× ຫຼື 10,000×.
ການວິເຄາະດ້ານຮູບຮ່າງຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍ. ສຳລັບການວິເຄາະທັງໝົດ, ຮູບຊົງຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍແຕ່ລະອັນໄດ້ຖືກກຳນົດດ້ວຍຕົນເອງໃນຮູບພາບດິຈິຕອນໂດຍໃຊ້ຊອບແວ ImageJ. ພາລາມິເຕີດ້ານຮູບຮ່າງທີ່ແຕກຕ່າງກັນໄດ້ຖືກວິເຄາະ. ຄວາມໜາແໜ້ນຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍສະແດງອອກເປັນເປີເຊັນທີ່ໄດ້ຮັບຈາກການແບ່ງພື້ນທີ່ໄມໂທຄອນເດຣຍທັງໝົດຂອງແຕ່ລະຈຸລັງດ້ວຍພື້ນທີ່ໄຊໂຕພລາຊຶມ (ພື້ນທີ່ໄຊໂຕພລາຊຶມ = ພື້ນທີ່ເຊວ-ພື້ນທີ່ນິວເຄຼຍຂອງເຊວ) × 100. ຄວາມກົມຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍຖືກຄິດໄລ່ດ້ວຍສູດ [4π∙(ພື້ນທີ່/ຮອບວົງ 2)]. ຮູບຊົງຂອງໄມໂທຄອນເດຣຍໄດ້ຖືກວິເຄາະ ແລະ ແບ່ງອອກເປັນສອງປະເພດ (“ທໍ່” ແລະ “ຕຸ່ມພອງ”) ຕາມຮູບຮ່າງຫຼັກຂອງມັນ.
ການວິເຄາະຈຳນວນ ແລະ ຄວາມໜາແໜ້ນຂອງ Autophagosome/lysosome. ໃຊ້ຊອບແວ ImageJ ເພື່ອກຳນົດຮູບຮ່າງຂອງແຕ່ລະ autophagosome/lysosome ໃນຮູບພາບດິຈິຕອນດ້ວຍຕົນເອງ. ພື້ນທີ່ Autophagosome/lysosome ແມ່ນສະແດງເປັນເປີເຊັນທີ່ຄິດໄລ່ໂດຍການຫານພື້ນທີ່ໂຄງສ້າງ autophagosome/lysosome ທັງໝົດຂອງແຕ່ລະຈຸລັງດ້ວຍພື້ນທີ່ cytoplasm (ພື້ນທີ່ cytoplasm = ພື້ນທີ່ຈຸລັງ - ພື້ນທີ່ນິວເຄຼຍສ໌) × 100. ຄວາມໜາແໜ້ນຂອງ autophagosome/lysosomes ແມ່ນຄິດໄລ່ໂດຍການຫານຈຳນວນທັງໝົດດ້ວຍຈຳນວນໂຄງສ້າງ autophagosome/lysosome ຕໍ່ຈຸລັງ (ໃນແງ່ຂອງພື້ນທີ່ cytoplasmic) (ພື້ນທີ່ cytoplasmic = ພື້ນທີ່ຈຸລັງ - ພື້ນທີ່ນິວເຄຼຍສ໌).
ການຕິດສະຫຼາກສຳລັບການຕັດແບບສ້ວຍແຫຼມ ແລະ ການກະກຽມຕົວຢ່າງ. ສຳລັບການທົດລອງທີ່ຕ້ອງການການຕິດສະຫຼາກນ້ຳຕານໃນເລືອດ, ໃຫ້ໂອນຊິ້ນສ່ວນສະໝອງສ້ວຍແຫຼມໄປຍັງຫ້ອງກ່ອນການບົ່ມເພາະ, ເຊິ່ງປະກອບດ້ວຍຄາບອນອີ່ມຕົວ (95% O2 ແລະ 5% CO2), Ca2 + ACSF ສູງ (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM ໂຊດຽມຟອສເຟດບັຟເຟີ, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 ແລະ 2.0 mM MgCl2, ປັບ pH 7.4 ແລະ 310 ຫາ 320 mOsm), ເຊິ່ງນ້ຳຕານໃນເລືອດແມ່ນ 13 C6- ການທົດແທນນ້ຳຕານໃນເລືອດ (Eurisotop, ໝາຍເລກລາຍການ CLM-1396). ສຳລັບການທົດລອງທີ່ຕ້ອງການການຕິດສະຫຼາກ pyruvate, ໃຫ້ໂອນຊິ້ນສ່ວນສະໝອງສ້ວຍແຫຼມໄປຫາ Ca2 + ACSF ທີ່ສູງກວ່າ (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 ແລະ ຕື່ມ 2.0 mM MgCl2, ປັບ pH ເປັນ 7.4 ແລະ 310 ຫາ 320mOsm), ແລະ ຕື່ມ 1mM 1-[1-13C]pyruvate (Eurisotop, ໝາຍເລກລາຍການ CLM-1082). ບົ່ມສ່ວນຕ່າງໆເປັນເວລາ 90 ນາທີທີ່ 37°C. ໃນຕອນທ້າຍຂອງການທົດລອງ, ສ່ວນຕ່າງໆໄດ້ຖືກລ້າງຢ່າງໄວວາດ້ວຍສານລະລາຍນ້ຳ (pH 7.4) ທີ່ມີ ammonium carbonate 75 mM, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນເຮັດໃຫ້ເປັນເອກະພາບໃນອັດຕາສ່ວນ 40:40:20 (v:v:v) acetonitrile (ACN): methanol: ນ້ຳ. ຫຼັງຈາກສ່ວນຕ່າງໆຖືກບົ່ມໃສ່ນ້ຳກ້ອນເປັນເວລາ 30 ນາທີ, ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກປั่นແຍກທີ່ 21,000 g ເປັນເວລາ 10 ນາທີ ທີ່ອຸນຫະພູມ 4°C, ແລະ ນ້ຳທີ່ໃສໄດ້ຖືກຕາກແຫ້ງໃນເຄື່ອງເຂັ້ມຂຸ້ນ SpeedVac. ເມັດ metabolite ແຫ້ງທີ່ໄດ້ຮັບໄດ້ຖືກເກັບຮັກສາໄວ້ທີ່ -80°C ຈົນກ່ວາການວິເຄາະ.
ການວິເຄາະດ້ວຍວິທີໂຄຣມາໂຕກຣາຟີ-ມວນສານແບບແຫຼວຂອງກົດອະມິໂນ 13 ຊະນິດທີ່ມີປ້າຍຊື່ C. ສຳລັບການວິເຄາະດ້ວຍວິທີໂຄຣມາໂຕກຣາຟີ-ມວນສານແບບແຫຼວ (LC-MS), ເມັດເມຕາໂບໄລທ໌ໄດ້ຖືກລະລາຍຄືນໃໝ່ໃນນ້ຳເກຣດ LC-MS 75μl (Honeywell). ຫຼັງຈາກການປั่นແຍກທີ່ 21,000 g ເປັນເວລາ 5 ນາທີ ທີ່ອຸນຫະພູມ 4°C, ນ້ຳຊຸບນ້ຳທີ່ບໍລິສຸດ 20 μl ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການວິເຄາະກະແສກົດອະມິໂນ, ໃນຂະນະທີ່ສານສະກັດທີ່ເຫຼືອໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ທັນທີສໍາລັບການວິເຄາະໄອອອນ (ເບິ່ງຂ້າງລຸ່ມນີ້). ການວິເຄາະກົດອະມິໂນໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ໂປໂຕຄອນອະນຸພັນເບນໂຊອິລຄລໍໄຣທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ກ່ອນໜ້ານີ້ (55, 56). ໃນຂັ້ນຕອນທໍາອິດ, ໂຊດຽມຄາບອນເນດ 100 mM (Sigma-Aldrich) 10μl ໄດ້ຖືກເພີ່ມໃສ່ສານສະກັດເມຕາໂບໄລທ໌ 20μl, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນ 10μl ຂອງເບນໂຊອິລຄລໍໄຣ (Sigma-Aldrich) 2% ໄດ້ຖືກເພີ່ມໃສ່ ACN ເກຣດ LC. ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກປັ່ນເປັນວົງສັ້ນໆ ແລະ ຫຼັງຈາກນັ້ນໄດ້ປั่นແຍກທີ່ 21,000 g ເປັນເວລາ 5 ນາທີ ທີ່ອຸນຫະພູມ 20°C. ຍ້າຍນ້ຳທີ່ລະລາຍແລ້ວໃສ່ຂວດເກັບຕົວຢ່າງອັດຕະໂນມັດ 2 ml ທີ່ມີຊ່ອງແກ້ວຮູບຈວຍ (ປະລິມານ 200 μl). ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກວິເຄາະໂດຍໃຊ້ລະບົບ LC ປະສິດທິພາບສູງພິເສດ Acquity iClass (Waters) ທີ່ເຊື່ອມຕໍ່ກັບເຄື່ອງວັດມວນສານຄວາມແມ່ນຍໍາສູງ Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). ສຳລັບການວິເຄາະ, 2μl ຂອງຕົວຢ່າງທີ່ໄດ້ມາໄດ້ຖືກສີດເຂົ້າໄປໃນຖັນ T3 ຊິລິກາທີ່ມີຄວາມແຂງແຮງສູງ 100×1.0 ມມ (Waters) ທີ່ມີອະນຸພາກ 1.8μm. ອັດຕາການໄຫຼແມ່ນ 100μl/ນາທີ, ແລະລະບົບບັຟເຟີປະກອບດ້ວຍບັຟເຟີ A (ຮູບແບບແອມໂມນຽມ 10 mM ແລະກົດຟໍມິກ 0.15% ໃນນ້ຳ) ແລະບັຟເຟີ B (ACN). ການປ່ຽນແປງມີດັ່ງນີ້: 0%B ທີ່ 0 ນາທີ; 0%B. 0 ຫາ 15% B ທີ່ 0 ຫາ 0.1 ນາທີ; 15 ຫາ 17% B ທີ່ 0.1 ຫາ 0.5 ນາທີ; B ທີ່ 17 ຫາ 55% ທີ່ 0.5 ຫາ 14 ນາທີ; B ທີ່ 55 ຫາ 70% ທີ່ 14 ຫາ 14.5 ນາທີ; ທີ່ 14.5 ຫາ 70 ຫາ 100% B ທີ່ 18 ນາທີ; 100% B ທີ່ 18 ຫາ 19 ນາທີ; 100 ຫາ 0% B ທີ່ 19 ຫາ 19.1 ນາທີ; 0% B ທີ່ 19.1 ຫາ 28 ນາທີ (55, 56). ເຄື່ອງວັດມວນສານ QE-HF ເຮັດວຽກໃນຮູບແບບໄອອອນໄນເຊຊັນບວກທີ່ມີລະດັບມວນສານ m/z (ອັດຕາສ່ວນມວນສານ/ປະຈຸ) 50 ຫາ 750. ຄວາມລະອຽດທີ່ນຳໃຊ້ແມ່ນ 60,000, ແລະເປົ້າໝາຍໄອອອນຄວບຄຸມການຂະຫຍາຍ (AGC) ທີ່ໄດ້ຮັບແມ່ນ 3×106, ແລະເວລາໄອອອນສູງສຸດແມ່ນ 100 ມິນລິວິນາທີ. ແຫຼ່ງໄອອອນໄນເຊຊັນໄຟຟ້າສະເປຣ (ESI) ເຮັດວຽກທີ່ແຮງດັນສະເປຣ 3.5 kV, ອຸນຫະພູມ capillary 250°C, ກະແສລົມຂອງເປືອກ 60 AU (ໜ່ວຍງານທີ່ບໍ່ຈຳເປັນ), ແລະກະແສລົມຊ່ວຍ 20 AU. 250°C. ເລນ S ຖືກຕັ້ງໄວ້ທີ່ 60 AU.
ການວິເຄາະດ້ວຍວິທີ Anion chromatography-MS ຂອງກົດອິນຊີທີ່ມີປ້າຍຊື່ 13C. ຕະກອນ metabolite ທີ່ຍັງເຫຼືອ (55μl) ໄດ້ຖືກວິເຄາະໂດຍໃຊ້ລະບົບ Dionex ion chromatography (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) ທີ່ເຊື່ອມຕໍ່ກັບເຄື່ອງວັດແທກມວນສານ QE-HF (Thermo Fisher Scientific). ສະຫຼຸບແລ້ວ, ສານສະກັດຈາກ metabolite 5μl ໄດ້ຖືກສີດເຂົ້າໄປໃນຖັນ Dionex IonPac AS11-HC ທີ່ມີ HPLC (2 mm × 250 mm, ຂະໜາດອະນຸພາກ 4μm, Thermo Fisher Scientific) ໃນໂໝດວົງຈອນບາງສ່ວນທີ່ຍູ້ເຂົ້າດ້ວຍອັດຕາສ່ວນການຕື່ມ 1.) ຖັນປ້ອງກັນ Dionex IonPac AG11-HC (2 mm x 50 mm, 4μm, Thermo Fisher Scientific). ອຸນຫະພູມຖັນຖືກຮັກສາໄວ້ທີ່ 30°C, ແລະຕົວເກັບຕົວຢ່າງອັດຕະໂນມັດຖືກຕັ້ງໄວ້ທີ່ 6°C. ໃຊ້ຕະຫຼັບໂພແທດຊຽມໄຮດຣອກໄຊດ໌ທີ່ມີນ້ຳທີ່ບໍ່ມີໄອອອນເພື່ອສ້າງຄວາມຜັນຜວນຂອງໂພແທດຊຽມໄຮດຣອກໄຊດ໌ຜ່ານເຄື່ອງກຳເນີດສານລະລາຍ. ການແຍກສານເມຕາໂບໄລໃນອັດຕາການໄຫຼ 380μl/ນາທີ, ໂດຍໃຊ້ຄວາມຜັນຜວນຕໍ່ໄປນີ້: 0 ຫາ 3 ນາທີ, 10 mM KOH; 3 ຫາ 12 ນາທີ, 10 ຫາ 50 mM KOH; 12 ຫາ 19 ນາທີ, 50 ຫາ 100 mM KOH; 19 ຫາ 21 ນາທີ, 100 mM KOH; 21 ຫາ 21.5 ນາທີ, 100 ຫາ 10 mM KOH. ຖັນໄດ້ຖືກປັບສົມດຸນຄືນໃໝ່ພາຍໃຕ້ 10 mM KOH ເປັນເວລາ 8.5 ນາທີ.
ສານເມຕາໂບໄລທີ່ຖືກລະລາຍແລ້ວຈະຖືກລວມເຂົ້າກັບກະແສເສີມໄອໂຊໂປຣພານອລ 150μl/ນາທີ ຫຼັງຈາກຖັນ ແລະ ຫຼັງຈາກນັ້ນສົ່ງໄປຫາເຄື່ອງວັດແທກມວນສານທີ່ມີຄວາມລະອຽດສູງ ເຊິ່ງເຮັດວຽກໃນຮູບແບບໄອອອນໄນເຊຊັນທາງລົບ. MS ກຳລັງຕິດຕາມກວດກາລະດັບມວນສານຕັ້ງແຕ່ m/z 50 ຫາ 750 ດ້ວຍຄວາມລະອຽດ 60,000. AGC ຖືກຕັ້ງໄວ້ທີ່ 1×106, ແລະ ເວລາໄອອອນສູງສຸດຖືກຮັກສາໄວ້ທີ່ 100 ms. ແຫຼ່ງ ESI ທີ່ມີຄວາມຮ້ອນໄດ້ຖືກເຮັດວຽກທີ່ແຮງດັນສີດພົ່ນ 3.5 kV. ການຕັ້ງຄ່າອື່ນໆຂອງແຫຼ່ງໄອອອນມີດັ່ງນີ້: ອຸນຫະພູມ capillary 275°C; ການໄຫຼຂອງອາຍແກັສ sheath, 60 AU; ການໄຫຼຂອງອາຍແກັສຊ່ວຍ, 20 AU ທີ່ 300°C, ແລະ ການຕັ້ງຄ່າເລນ S ເປັນ 60 AU.
ການວິເຄາະຂໍ້ມູນຂອງສານແປຮູບທີ່ມີປ້າຍຊື່ 13C. ໃຊ້ຊອບແວ TraceFinder (ເວີຊັນ 4.2, Thermo Fisher Scientific) ສຳລັບການວິເຄາະຂໍ້ມູນຂອງອັດຕາສ່ວນໄອໂຊໂທບ. ເອກະລັກຂອງແຕ່ລະສານປະກອບໄດ້ຮັບການຢືນຢັນໂດຍສານປະກອບອ້າງອີງທີ່ເຊື່ອຖືໄດ້ ແລະ ວິເຄາະຢ່າງເປັນອິດສະຫຼະ. ເພື່ອປະຕິບັດການວິເຄາະການເສີມທາດໄອໂຊໂທບ, ພື້ນທີ່ຂອງໂຄຣມາໂຕແກຣມໄອອອນທີ່ສະກັດອອກມາ (XIC) ຂອງແຕ່ລະໄອໂຊໂທບ 13C (Mn) ໄດ້ຖືກສະກັດຈາກ [M + H] +, ບ່ອນທີ່ n ແມ່ນຈຳນວນຄາບອນຂອງສານປະກອບເປົ້າໝາຍ, ໃຊ້ເພື່ອວິເຄາະກົດອະມິໂນ ຫຼື [MH] + ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອວິເຄາະອະນຸພາກແອນອີອອນ. ຄວາມຖືກຕ້ອງຂອງມວນສານຂອງ XIC ແມ່ນໜ້ອຍກວ່າຫ້າສ່ວນຕໍ່ລ້ານ, ແລະ ຄວາມຖືກຕ້ອງຂອງ RT ແມ່ນ 0.05 ນາທີ. ການວິເຄາະການເສີມທາດແມ່ນປະຕິບັດໂດຍການຄິດໄລ່ອັດຕາສ່ວນຂອງແຕ່ລະໄອໂຊໂທບທີ່ກວດພົບຕໍ່ກັບຜົນບວກຂອງໄອໂຊໂທບທັງໝົດຂອງສານປະກອບທີ່ສອດຄ້ອງກັນ. ອັດຕາສ່ວນເຫຼົ່ານີ້ແມ່ນໃຫ້ເປັນຄ່າເປີເຊັນສຳລັບແຕ່ລະໄອໂຊໂທບ, ແລະ ຜົນໄດ້ຮັບແມ່ນສະແດງອອກເປັນການເສີມທາດເປີເຊັນໂມລາ (MPE), ດັ່ງທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ກ່ອນໜ້ານີ້ (42).
ເມັດເຊວປະສາດແຊ່ແຂງໄດ້ຖືກເຮັດໃຫ້ເປັນເອກະພາບໃນເມທານອນ 80% ເຢັນ (v/v), ຖືກໝຸນວຽນ, ແລະ ບົ່ມໄວ້ທີ່ -20°C ເປັນເວລາ 30 ນາທີ. ໝຸນຕົວຢ່າງອີກຄັ້ງ ແລະ ຄົນທີ່ +4°C ເປັນເວລາ 30 ນາທີ. ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກປั่นແຍກທີ່ 21,000 g ເປັນເວລາ 5 ນາທີ ທີ່ 4°C, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນນ້ຳທີ່ໄຫຼອອກມາໄດ້ຖືກເກັບກຳ ແລະ ເຮັດໃຫ້ແຫ້ງໂດຍໃຊ້ເຄື່ອງສຸມ SpeedVac ທີ່ 25°C ສຳລັບການວິເຄາະຕໍ່ມາ. ດັ່ງທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ຂ້າງເທິງ, ການວິເຄາະ LC-MS ໄດ້ຖືກປະຕິບັດກ່ຽວກັບກົດອະມິໂນຂອງຈຸລັງທີ່ຄັດແຍກແລ້ວ. ໂດຍໃຊ້ TraceFinder (ລຸ້ນ 4.2, Thermo Fisher Scientific), ການວິເຄາະຂໍ້ມູນໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ມວນສານ monoisotopic ຂອງແຕ່ລະສານປະກອບ. ການເຮັດໃຫ້ຂໍ້ມູນ metabolite ເປັນປົກກະຕິຕາມປະລິມານໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ຊຸດຊອບແວ preprocessCore (57).
ການກະກຽມຊອຍ. ໜູໄດ້ຖືກໃຫ້ຢາສະລົບຢ່າງໄວວາດ້ວຍຄາບອນໄດອອກໄຊ ແລະ ຕັດຫົວ, ສະໝອງໄດ້ຖືກເອົາອອກຈາກກະໂຫຼກຢ່າງໄວວາ, ແລະ ມີດສັ່ນທີ່ເຕັມໄປດ້ວຍນ້ຳກ້ອນ (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, ເຢຍລະມັນ) ໄດ້ຖືກນຳໃຊ້ເພື່ອຕັດມັນເປັນສ່ວນໆ sagittal ຂະໜາດ 300 ຫາ 375 μm. ການແຍກເປັນແກັສຄາບອນເຢັນ (95% O2 ແລະ 5% CO2) Ca2 + ACSF ຕ່ຳ (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 ແລະ 6.0 mM MgCl2 ປັບໃຫ້ເປັນ pH 7.4 ແລະ 310 ຫາ 330 mOsm). ຍ້າຍຊິ້ນສ່ວນສະໝອງທີ່ໄດ້ຮັບໄປຫ້ອງທີ່ມີ Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM ໂຊດຽມຟອສເຟດບັຟເຟີ, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 4.0 mM CaCl2 ແລະ mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 ແລະ 310 ຫາ 320 mOsm). ເກັບຮັກສາຊິ້ນສ່ວນສະໝອງໄວ້ປະມານ 20 ຫາ 30 ນາທີ ເພື່ອໃຫ້ພວກມັນສາມາດຟື້ນຟູໄດ້ກ່ອນການບັນທຶກ.
ການບັນທຶກ. ເວທີກ້ອງຈຸລະທັດທີ່ມີຫ້ອງບັນທຶກຄົງທີ່ ແລະ ເລນວັດຖຸທີ່ຈຸ່ມນ້ຳ 20x (Scientifica) ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການບັນທຶກທັງໝົດ. ຈຸລັງ Purkinje ທີ່ເປັນໄປໄດ້ໄດ້ຖືກລະບຸໂດຍ (i) ຂະໜາດຂອງຮ່າງກາຍ, (ii) ຕໍາແຫນ່ງທາງກາຍວິພາກຂອງ cerebellum, ແລະ (iii) ການສະແດງອອກຂອງ gene mtYFP reporter fluorescent. pipette patch ທີ່ມີຄວາມຕ້ານທານປາຍ 5 ຫາ 11 megohms ຖືກດຶງອອກໂດຍ capillary ແກ້ວ borosilicate (GB150-10, 0.86 mm × 1.5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, ເຢຍລະມັນ) ແລະ pipette horizontal Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA). ການບັນທຶກທັງໝົດໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍ ELC-03XS npi patch clamp amplifier (npi electronic GmbH, Tam, ເຢຍລະມັນ), ເຊິ່ງຖືກຄວບຄຸມໂດຍຊອບແວ Signal (ເວີຊັນ 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK). ການທົດລອງໄດ້ຖືກບັນທຶກໄວ້ໃນອັດຕາການເກັບຕົວຢ່າງ 12.5 kHz. ສັນຍານຖືກກັ່ນຕອງດ້ວຍຕົວກອງ Bessel ທາງຜ່ານສັ້ນສອງຕົວທີ່ມີຄວາມຖີ່ຕັດ 1.3 ແລະ 10 kHz ຕາມລຳດັບ. ຄວາມຈຸຂອງເຍື່ອ ແລະ pipette ໄດ້ຮັບການຊົດເຊີຍໂດຍວົງຈອນຊົດເຊີຍໂດຍໃຊ້ເຄື່ອງຂະຫຍາຍສຽງ. ການທົດລອງທັງໝົດໄດ້ຖືກປະຕິບັດພາຍໃຕ້ການຄວບຄຸມຂອງກ້ອງຖ່າຍຮູບ Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, ເຢຍລະມັນ), ເຊິ່ງຖືກຄວບຄຸມໂດຍຊອບແວ Hokawo (ເວີຊັນ 2.8, Hamamatsu, Gerden, ເຢຍລະມັນ).
ການຕັ້ງຄ່າ ແລະ ການວິເຄາະຈຸລັງທັງໝົດຕາມປົກກະຕິ. ທັນທີກ່ອນການບັນທຶກ, ໃຫ້ຕື່ມ pipette ດ້ວຍສານລະລາຍພາຍໃນທີ່ມີສານຕໍ່ໄປນີ້: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM potassium gluconate, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM Guanosine triphosphate (GTP) (Na) ແລະ 10.0 mM creatinine phosphate ໄດ້ຖືກປັບໃຫ້ເປັນ pH 7.25, ແລະ ຄວາມດັນ osmotic ແມ່ນ 290 mOsm (sucrose). ທັນທີຫຼັງຈາກໃຊ້ແຮງ 0 pA ເພື່ອແຕກເຍື່ອ, ສັກຍະພາບຂອງເຍື່ອທີ່ພັກຜ່ອນໄດ້ຖືກວັດແທກ. ຄວາມຕ້ານທານຂາເຂົ້າຖືກວັດແທກໂດຍການໃຊ້ກະແສໄຟຟ້າ hyperpolarized ຂອງ -40, -30, -20, ແລະ -10 pA. ວັດແທກຂະໜາດຂອງການຕອບສະໜອງແຮງດັນ ແລະ ໃຊ້ກົດຂອງ Ohm ເພື່ອຄິດໄລ່ຄວາມຕ້ານທານຂາເຂົ້າ. ກິດຈະກຳທີ່ເກີດຂຶ້ນເອງໄດ້ຖືກບັນທຶກໄວ້ໃນເຄື່ອງໜີບແຮງດັນເປັນເວລາ 5 ນາທີ, ແລະ sPSC ໄດ້ຖືກລະບຸ ແລະ ວັດແທກໃນ Igor Pro (ເວີຊັນ 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, ສະຫະລັດອາເມລິກາ) ໂດຍໃຊ້ສະຄຣິບການຮັບຮູ້ແບບເຄິ່ງອັດຕະໂນມັດ. ເສັ້ນໂຄ້ງ IV ແລະ ກະແສໄຟຟ້າໃນສະພາບຄົງທີ່ໄດ້ຖືກວັດແທກໂດຍການໜີບແບັດເຕີຣີທີ່ທ່າແຮງທີ່ແຕກຕ່າງກັນ (ເລີ່ມຕົ້ນຈາກ -110 mV) ແລະ ເພີ່ມແຮງດັນໃນຂັ້ນຕອນ 5 mV. ການຜະລິດ AP ໄດ້ຖືກທົດສອບໂດຍການໃຊ້ກະແສໄຟຟ້າຫຼຸດຂົ້ວ. ໜີບເຊວທີ່ -70 mV ໃນຂະນະທີ່ໃຊ້ກຳມະຈອນກະແສໄຟຟ້າຫຼຸດຂົ້ວ. ປັບຂະໜາດຂັ້ນຕອນຂອງແຕ່ລະໜ່ວຍບັນທຶກແຍກຕ່າງຫາກ (10 ຫາ 60 pA). ຄິດໄລ່ຄວາມຖີ່ AP ສູງສຸດໂດຍການນັບການເພີ່ມຂຶ້ນຂອງກຳມະຈອນທີ່ເຮັດໃຫ້ເກີດຄວາມຖີ່ AP ສູງສຸດດ້ວຍຕົນເອງ. ຂອບເຂດ AP ຖືກວິເຄາະໂດຍການໃຊ້ອະນຸພັນທີສອງຂອງກຳມະຈອນຫຼຸດຂົ້ວທີ່ກະຕຸ້ນ AP ໜຶ່ງ ຫຼື ຫຼາຍອັນກ່ອນ.
ການຕັ້ງຄ່າ ແລະ ການວິເຄາະແຜ່ນເຈາະຮູ. ປະຕິບັດການບັນທຶກແຜ່ນເຈາະຮູໂດຍໃຊ້ໂປໂຕຄອນມາດຕະຖານ. ໃຊ້ pipette ທີ່ບໍ່ມີ ATP ແລະ GTP ທີ່ບໍ່ມີສ່ວນປະກອບຕໍ່ໄປນີ້: 128 mM gluconate K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA ແລະ 2 mM MgCl2, ແລະ ປັບໃຫ້ເປັນ pH 7.2 (ໂດຍໃຊ້ KOH). ATP ແລະ GTP ຖືກຍົກເວັ້ນຈາກສານລະລາຍພາຍໃນຈຸລັງເພື່ອປ້ອງກັນການຊຶມເຂົ້າຂອງເຍື່ອຫຸ້ມຈຸລັງທີ່ບໍ່ສາມາດຄວບຄຸມໄດ້. pipette ແຜ່ນເຈາະຮູຖືກເຕີມດ້ວຍສານລະລາຍພາຍໃນທີ່ມີ amphotericin (ປະມານ 200 ຫາ 250μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) ເພື່ອໃຫ້ໄດ້ບັນທຶກແຜ່ນເຈາະຮູ. Amphotericin ໄດ້ຖືກລະລາຍໃນ dimethyl sulfoxide (ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນສຸດທ້າຍ: 0.1 ຫາ 0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ DMSO ທີ່ໃຊ້ບໍ່ມີຜົນກະທົບທີ່ສຳຄັນຕໍ່ເຊວປະສາດທີ່ໄດ້ສຶກສາ. ໃນລະຫວ່າງຂະບວນການເຈາະ, ຄວາມຕ້ານທານຂອງຊ່ອງທາງ (Ra) ໄດ້ຖືກຕິດຕາມກວດກາຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງ, ແລະການທົດລອງໄດ້ເລີ່ມຕົ້ນຫຼັງຈາກຄວາມກວ້າງຂອງ Ra ແລະ AP ໝັ້ນຄົງ (20-40 ນາທີ). ກິດຈະກຳທີ່ເກີດຂຶ້ນເອງຖືກວັດແທກໃນຕົວໜີບແຮງດັນ ແລະ/ຫຼື ກະແສໄຟຟ້າເປັນເວລາ 2 ຫາ 5 ນາທີ. ການວິເຄາະຂໍ້ມູນໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ Igor Pro (ເວີຊັນ 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (ເວີຊັນ 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) ແລະ GraphPad Prism (ເວີຊັນ 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). ສະຫະລັດອາເມລິກາ. ເພື່ອລະບຸ AP ທີ່ເກີດຂຶ້ນເອງ, ປລັກອິນ NeuroMatic v3.0c ຂອງ IgorPro ຖືກນຳໃຊ້. ລະບຸ AP ໂດຍອັດຕະໂນມັດໂດຍໃຊ້ຂອບເຂດທີ່ກຳນົດໃຫ້, ເຊິ່ງຖືກປັບເປັນສ່ວນບຸກຄົນສຳລັບແຕ່ລະບັນທຶກ. ໂດຍໃຊ້ໄລຍະຫ່າງຂອງ spike, ກຳນົດຄວາມຖີ່ຂອງ spike ດ້ວຍຄວາມຖີ່ຂອງ spike ທັນທີສູງສຸດ ແລະ ຄວາມຖີ່ຂອງ spike ສະເລ່ຍ.
ການແຍກ PN. ໂດຍການປັບຕົວເຂົ້າກັບໂປໂຕຄອນທີ່ເຜີຍແຜ່ກ່ອນໜ້ານີ້, PNs ໄດ້ຖືກບໍລິສຸດຈາກ cerebellum ຂອງໜູໃນໄລຍະທີ່ກຳນົດໄວ້ (58). ສະຫຼຸບແລ້ວ, cerebellum ໄດ້ຖືກຜ່າຕັດ ແລະ ຟັກໃນສື່ກາງການແຍກຕົວທີ່ເຢັນ [ໂດຍບໍ່ມີ HBSS Ca2+ ແລະ Mg2+, ເສີມດ້ວຍນ້ຳຕານ glucose 20 mM, penicillin (50 U/ml) ແລະ streptomycin (0.05 mg/ml)], ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນຍ່ອຍສື່ກາງໃນ papain [HBSS, ເສີມດ້ວຍ 1-cysteine·HCl (1 mg/ml), papain (16 U/ml) ແລະ deoxyribonuclease I (DNase I; 0.1 mg/ml)] ຮັກສາເປັນເວລາ 30 ນາທີທີ່ 30°C. ກ່ອນອື່ນໝົດລ້າງເນື້ອເຍື່ອໃນສານ HBSS ທີ່ມີນໍ້າເມືອກໄຂ່ (10 ມກ/ມລ), BSA (10 ມກ/ມລ) ແລະ DNase (0.1 ມກ/ມລ) ທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງເພື່ອປ້ອງກັນການຍ່ອຍສະຫຼາຍຂອງເອນໄຊມ໌, ແລະຈາກນັ້ນໃນສານ HBSS ທີ່ມີນໍ້າຕານກລູໂຄສ 20 mM ບົດຄ່ອຍໆໃນ HBSS, ເປນີຊີລິນ (50 U/ມລ), ສະເຕຣບໂຕໄມຊິນ (0.05 ມກ/ມລ) ແລະ DNase (0.1 ມກ/ມລ) ປ່ອຍຈຸລັງດ່ຽວອອກມາ. ສານລະລາຍຈຸລັງທີ່ໄດ້ຮັບໄດ້ຖືກກັ່ນຕອງຜ່ານເຄື່ອງກອງຈຸລັງຂະໜາດ 70μm, ຫຼັງຈາກນັ້ນຈຸລັງໄດ້ຖືກບີບເປັນເມັດໂດຍການປั่นແຍກ (1110 rpm, 5 ນາທີ, 4°C) ແລະລະລາຍຄືນໃໝ່ໃນສານຄັດແຍກ [HBSS, ເສີມດ້ວຍນໍ້າຕານກລູໂຄສ 20 mM, 20% ຂອງງົວໃນທ້ອງ), ເປນີຊີລິນ (50 U/ມລ) ແລະ ສະເຕຣບໂຕໄມຊິນ (0.05 ມກ/ມລ)]; ປະເມີນຄວາມຢູ່ລອດຂອງຈຸລັງດ້ວຍໂພຣພີເດຍມ iodide ແລະປັບຄວາມໜາແໜ້ນຂອງຈຸລັງໃຫ້ເປັນ 1 × 106 ຫາ 2 × 106 ຈຸລັງ/ມລ. ກ່ອນການວິເຄາະການໄຫຼຂອງໄຊໂຕເມຕຣີ, ສານລະລາຍໄດ້ຖືກກັ່ນຕອງຜ່ານຕົວກອງຈຸລັງຂະໜາດ 50 μm.
ເຄື່ອງວັດແທກການໄຫຼຂອງຈຸລັງ. ການຈັດຮຽງຈຸລັງໄດ້ຖືກປະຕິບັດຢູ່ທີ່ 4°C ໂດຍໃຊ້ເຄື່ອງ FACSAria III (BD Biosciences) ແລະຊອບແວ FACSDiva (BD Biosciences, ເວີຊັນ 8.0.1). ການລະງັບຈຸລັງໄດ້ຖືກຈັດຮຽງໂດຍໃຊ້ຫົວສີດ 100 μm ພາຍໃຕ້ຄວາມກົດດັນ 20 psi ໃນອັດຕາ ~2800 ເຫດການ/ວິນາທີ. ເນື່ອງຈາກເກນການ gating ແບບດັ້ງເດີມ (ຂະໜາດຈຸລັງ, ການຈຳແນກ bimodal, ແລະລັກສະນະການກະແຈກກະຈາຍ) ບໍ່ສາມາດຮັບປະກັນການແຍກ PN ທີ່ຖືກຕ້ອງຈາກຈຸລັງປະເພດອື່ນໆ, ຍຸດທະສາດ gating ຖືກກຳນົດໂດຍອີງໃສ່ການປຽບທຽບໂດຍກົງຂອງຄວາມເຂັ້ມຂອງ YFP ແລະ autofluorescence ໃນ mitoYFP+ ​​​​ແລະໜູ mitoYFP − ຄວບຄຸມ. YFP ຖືກກະຕຸ້ນໂດຍການສ່ອງແສງຕົວຢ່າງດ້ວຍສາຍເລເຊີ 488 nm, ແລະສັນຍານຖືກກວດພົບໂດຍໃຊ້ຕົວກອງ band pass 530/30 nm. ໃນໜູ mitoYFP+, ຄວາມເຂັ້ມແຂງທຽບເທົ່າຂອງ gene ນັກຂ່າວ Rosa26-mitoYFP ຍັງຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອຈໍາແນກຊິ້ນສ່ວນຂອງຮ່າງກາຍ neuronal ແລະຊິ້ນສ່ວນ axon. 7-AAD ຖືກກະຕຸ້ນດ້ວຍເລເຊີສີເຫຼືອງ 561 nm ແລະ ກວດພົບດ້ວຍຕົວກອງແບນພາສ 675/20 nm ເພື່ອແຍກເຊວທີ່ຕາຍແລ້ວອອກ. ເພື່ອແຍກ astrocytes ໃນເວລາດຽວກັນ, ເຊວທີ່ຖືກຍ້ອມສີດ້ວຍ ACSA-2-APC, ຫຼັງຈາກນັ້ນຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກສ່ອງແສງດ້ວຍເສັ້ນເລເຊີ 640 nm, ແລະ ຕົວກອງແບນພາສ 660/20 nm ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອກວດຫາສັນຍານ.
ຈຸລັງທີ່ເກັບມາໄດ້ຖືກບີບອັດເປັນເມັດໂດຍການປั่นແຍກ (1110 rpm, 5 ນາທີ, 4°C) ແລະເກັບຮັກສາໄວ້ທີ່ -80°C ຈົນກວ່າຈະນຳໃຊ້. ໜູ Mfn2cKO ແລະລູກໜູຂອງພວກມັນຖືກຈັດປະເພດໃນມື້ດຽວກັນເພື່ອຫຼຸດຜ່ອນການປ່ຽນແປງຂອງຂັ້ນຕອນ. ການນຳສະເໜີ ແລະ ການວິເຄາະຂໍ້ມູນ FACS ໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ຊອບແວ FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
ດັ່ງທີ່ໄດ້ກ່າວມາຂ້າງເທິງ (59), PCR ແບບເວລາຈິງແມ່ນໃຊ້ເພື່ອແຍກ DNA ຈາກເຊວປະສາດທີ່ຖືກຄັດແຍກສຳລັບການວັດປະລິມານ mtDNA ຕໍ່ມາ. ຄວາມອ່ອນໄຫວຂອງຄວາມເປັນເສັ້ນຊື່ ແລະ ຄວາມອ່ອນໄຫວຂອງຂອບເຂດໄດ້ຖືກທົດສອບໃນເບື້ອງຕົ້ນໂດຍການໃຊ້ qPCR ໃນຈຳນວນເຊວທີ່ແຕກຕ່າງກັນ. ໂດຍຫຍໍ້, ເກັບ 300 PN ໃນບັຟເຟີ lysis ທີ່ປະກອບດ້ວຍ 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 ແລະ proteinase K (200 ng/ml) ແລະ ບົ່ມຢູ່ທີ່ 55°C 120 ນາທີ. ເຊວໄດ້ຖືກບົ່ມຕື່ມອີກທີ່ 95°C ເປັນເວລາ 10 ນາທີເພື່ອຮັບປະກັນການຢຸດການເຄື່ອນໄຫວຂອງ proteinase K ຢ່າງສົມບູນ. ໂດຍໃຊ້ໂພຣບ TaqMan (Thermo Fisher) ສະເພາະກັບ mt-Nd1, mtDNA ໄດ້ຖືກວັດແທກໂດຍ PCR ແບບເຄິ່ງປະລິມານໃນລະບົບ PCR ແບບເວລາຈິງ 7900HT (Thermo Fisher Scientific). ວິທະຍາສາດ, ໝາຍເລກລາຍການ Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, ໝາຍເລກລາຍການ AIVI3E8) ແລະ 18S (Thermo Fisher Scientific, ໝາຍເລກລາຍການ Hs99999901_s1).
ການກະກຽມຕົວຢ່າງໂປຣຕີໂອມ. ໂດຍການໃຫ້ຄວາມຮ້ອນແກ່ສານລະລາຍທີ່ອຸນຫະພູມ 95°C ເປັນເວລາ 10 ນາທີ ແລະ sonicated, ໃນ lysis buffer [6 M guanidine chloride, 10 mM tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride, 10 mM chloroacetamide ແລະ 100 mM tris-Lyse frozen neuron pellets ໃນ HCl]. ໃນ Bioruptor (Diagenode) ເປັນເວລາ 10 ນາທີ (30 ວິນາທີ pulse / 30 ວິນາທີ pause period). ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກເຈືອຈາງ 1:10 ໃນ 20 mM tris-HCl (pH 8.0), ປະສົມກັບ 300 ng trypsin gold (Promega), ແລະ ບົ່ມໄວ້ຄ້າງຄືນທີ່ອຸນຫະພູມ 37°C ເພື່ອໃຫ້ການຍ່ອຍສະຫຼາຍສົມບູນ. ໃນມື້ທີສອງ, ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກ centrifuge ທີ່ 20,000 g ເປັນເວລາ 20 ນາທີ. ສ່ວນເກີນໄດ້ຖືກເຈືອຈາງດ້ວຍກົດ formic 0.1%, ແລະ ສານລະລາຍໄດ້ຖືກລະລາຍດ້ວຍ StageTips ທີ່ເຮັດເອງ. ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກຕາກແຫ້ງໃນເຄື່ອງມື SpeedVac (ເຄື່ອງເຂັ້ມຂຸ້ນ Eppendorf ບວກກັບ 5305) ທີ່ອຸນຫະພູມ 45°C, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນ peptide ໄດ້ຖືກລະລາຍໃນກົດ formic 0.1%. ຕົວຢ່າງທັງໝົດໄດ້ຖືກກະກຽມພ້ອມໆກັນໂດຍຄົນດຽວກັນ. ເພື່ອວິເຄາະຕົວຢ່າງ astrocyte, peptides ທີ່ຖືກແຍກເກືອ 4 μg ໄດ້ຖືກຕິດສະຫຼາກດ້ວຍປ້າຍ tandem mass (TMT10plex, ໝາຍເລກລາຍການ 90110, Thermo Fisher Scientific) ດ້ວຍອັດຕາສ່ວນ peptide ຕໍ່ reagent TMT 1:20. ສຳລັບການຕິດສະຫຼາກ TMT, reagent TMT 0.8 mg ໄດ້ຖືກລະລາຍຄືນໃໝ່ໃນ 70 μl ຂອງ ACN ທີ່ບໍ່ມີນ້ຳ, ແລະ peptide ທີ່ແຫ້ງໄດ້ຖືກປະສົມເຂົ້າກັບ 9 μl ຂອງ 0.1 M TEAB (triethylammonium bicarbonate), ເຊິ່ງໄດ້ເພີ່ມ 7 μl ຂອງ reagent TMT ໃນ ACN. ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນແມ່ນ 43.75%. ຫຼັງຈາກການຟັກຕົວ 60 ນາທີ, ປະຕິກິລິຍາໄດ້ຖືກດັບລົງດ້ວຍ 2 μl ຂອງ 5% hydroxylamine. ເພບໄທດ໌ທີ່ຕິດສະຫຼາກໄດ້ຖືກເກັບກຳ, ຕາກແຫ້ງ, ລະລາຍຄືນໃໝ່ໃນ 200μl ຂອງກົດຟໍມິກ (FA) 0.1%, ແບ່ງອອກເປັນສອງສ່ວນ, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນແຍກເກືອໂດຍໃຊ້ StageTips ທີ່ຜະລິດເອງ. ໂດຍໃຊ້ໂຄຣມາໂຕກຣາຟີຂອງແຫຼວປະສິດທິພາບສູງພິເສດ UltiMate 3000 (ໂຄຣມາໂຕກຣາຟີຂອງແຫຼວປະສິດທິພາບສູງພິເສດ UltiMate 3000), ໜຶ່ງໃນສອງສ່ວນເຄິ່ງໄດ້ຖືກແຍກສ່ວນໃນຖັນໂຄຣມາໂຕກຣາຟີ Acquity ຂະໜາດ 1mm x 150mm ທີ່ເຕັມໄປດ້ວຍອະນຸພາກ C18 130Å1.7μm (Waters, ໝາຍເລກລາຍການ SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). ແຍກເພບໄທດ໌ໃນອັດຕາການໄຫຼ 30μl/ນາທີ, ແຍກຈາກ 1% ຫາ 50% ບັຟເຟີ B ເປັນເວລາ 85 ນາທີ ດ້ວຍຄວາມຜັນປ່ຽນແບບເທື່ອລະກ້າວ 96 ນາທີ, ຈາກ 50% ຫາ 95% ບັຟເຟີ B ເປັນເວລາ 3 ນາທີ, ຈາກນັ້ນ 8 ນາທີສຳລັບ 95% ບັຟເຟີ B; ບັຟເຟີ A ແມ່ນ 5% ACN ແລະ 10 mM ammonium bicarbonate (ABC), ແລະ ບັຟເຟີ B ແມ່ນ 80% ACN ແລະ 10 mM ABC. ເກັບກຳສ່ວນປະສົມທຸກໆ 3 ນາທີ ແລະ ລວມເຂົ້າກັນເປັນສອງກຸ່ມ (1 + 17, 2 + 18, ແລະອື່ນໆ) ແລະ ເຮັດໃຫ້ແຫ້ງໃນເຄື່ອງປั่นແຍກສູນຍາກາດ.
ການວິເຄາະ LC-MS/MS. ສຳລັບການວິເຄາະມວນສານ, peptides (ໝາຍເລກ r119.aq) ໄດ້ຖືກແຍກອອກໃນຖັນວິເຄາະ PicoFrit ຂະໜາດ 25 ຊມ, ເສັ້ນຜ່າສູນກາງພາຍໃນ 75 μm (ເລນວັດຖຸໃໝ່, ໝາຍເລກຊິ້ນສ່ວນ PF7508250) ພ້ອມດ້ວຍຕົວກາງ ReproSil-Pur 120 C18-AQ ຂະໜາດ 1.9 μm (Dr. Maisch, mat), ໃຊ້ EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, ເຢຍລະມັນ). ຖັນໄດ້ຖືກຮັກສາໄວ້ທີ່ 50°C. ບັຟເຟີ A ແລະ B ແມ່ນກົດຟໍມິກ 0.1% ໃນນ້ຳ ແລະ ກົດຟໍມິກ 0.1% ໃນ ACN 80% ຕາມລຳດັບ. peptides ໄດ້ຖືກແຍກອອກຈາກບັຟເຟີ B 6% ຫາ 31% ເປັນເວລາ 65 ນາທີ ແລະ ຈາກບັຟເຟີ B 31% ຫາ 50% ເປັນເວລາ 5 ນາທີ ດ້ວຍ gradient 200 nl/ນາທີ. peptides ທີ່ລະລາຍໄດ້ຖືກວິເຄາະໃນເຄື່ອງວັດແທກມວນສານ Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). ການວັດແທກ m/z ຂອງຕົວຕັ້ງຕົ້ນ peptide ຖືກປະຕິບັດດ້ວຍຄວາມລະອຽດ 120,000 ໃນລະດັບ 350 ຫາ 1500 m/z. ໂດຍໃຊ້ພະລັງງານການຊົນກັນປົກກະຕິ 27%, ຕົວຕັ້ງຕົ້ນທີ່ເຂັ້ມແຂງທີ່ສຸດທີ່ມີສະຖານະປະຈຸ 2 ຫາ 6 ແມ່ນຖືກເລືອກສຳລັບການແຍກຕົວອອກຈາກກັບດັກ C ພະລັງງານສູງ (HCD). ເວລາຮອບວຽນຖືກຕັ້ງໄວ້ທີ່ 1 ວິນາທີ. ຄ່າ m/z ຂອງຊິ້ນສ່ວນ peptide ໄດ້ຖືກວັດແທກໃນກັບດັກໄອອອນໂດຍໃຊ້ເປົ້າໝາຍ AGC ທີ່ນ້ອຍທີ່ສຸດ 5×104 ແລະເວລາສີດສູງສຸດ 86 ms. ຫຼັງຈາກການແບ່ງສ່ວນ, ຕົວຕັ້ງຕົ້ນໄດ້ຖືກວາງໄວ້ໃນລາຍຊື່ການຍົກເວັ້ນແບບໄດນາມິກເປັນເວລາ 45 ວິນາທີ. peptides ທີ່ຕິດສະຫຼາກ TMT ໄດ້ຖືກແຍກອອກໃນຖັນ Acclaim PepMap ຂະໜາດ 50 ຊມ, 75 μm (Thermo Fisher Scientific, ໝາຍເລກລາຍການ 164942), ແລະ ສະເປກຕຣຳການເຄື່ອນຍ້າຍໄດ້ຖືກວິເຄາະໃນເຄື່ອງວັດແທກມວນສານ Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) ທີ່ມີອຸປະກອນໄອອອນຮູບແບບຄື້ນບໍ່ສະເໝີພາບພາກສະໜາມສູງ (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific) ເຮັດວຽກທີ່ແຮງດັນຊົດເຊີຍສອງອັນຄື −50 ແລະ −70 V. MS3 ທີ່ເລືອກໂດຍອີງໃສ່ຕົວກຳນົດການຊິ້ງໂຄຣໄນຊັນແມ່ນໃຊ້ສຳລັບການວັດແທກສັນຍານໄອອອນລາຍງານ TMT. ການແຍກ peptide ໄດ້ຖືກປະຕິບັດໃນ EASY-nLC 1200, ໂດຍໃຊ້ການລະລາຍແບບເສັ້ນຊື່ 90%, ດ້ວຍຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງບັຟເຟີ 6% ຫາ 31%; ບັຟເຟີ A ແມ່ນ 0.1% FA, ແລະ ບັຟເຟີ B ແມ່ນ 0.1% FA ແລະ 80% ACN. ຖັນວິເຄາະແມ່ນເຮັດວຽກທີ່ 50°C. ໃຊ້ FreeStyle (ເວີຊັນ 1.6, Thermo Fisher Scientific) ເພື່ອແບ່ງໄຟລ໌ຕົ້ນສະບັບຕາມແຮງດັນຊົດເຊີຍ FAIMS.
ການກຳນົດ ແລະ ການວັດແທກປະລິມານໂປຣຕີນ. ໂດຍການໃຊ້ເຄື່ອງຈັກຊອກຫາ Andromeda ແບບປະສົມປະສານ, ຂໍ້ມູນຕົ້ນສະບັບໄດ້ຖືກວິເຄາະໂດຍໃຊ້ MaxQuant ເວີຊັນ 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). ນອກເໜືອໄປຈາກລຳດັບ Cre recombinase ແລະ YFP ທີ່ໄດ້ມາຈາກ Aequorea victoria, ສະເປກຕຣຳຊິ້ນສ່ວນ peptide ໄດ້ຖືກຄົ້ນຫາສຳລັບລຳດັບ canonical ແລະ ລຳດັບ isoform ຂອງໂປຣຕີໂອມອ້າງອີງຂອງໜູ (Proteome ID UP000000589, ດາວໂຫຼດຈາກ UniProt ໃນເດືອນພຶດສະພາ 2017). ການຜຸພັງ Methionine ແລະ acetylation ຂອງໂປຣຕີນ N-terminal ໄດ້ຖືກຕັ້ງເປັນການດັດແປງທີ່ປ່ຽນແປງໄດ້; cysteine ​​​​carbamoyl methylation ໄດ້ຖືກຕັ້ງເປັນການດັດແປງຄົງທີ່. ພາລາມິເຕີການຍ່ອຍອາຫານຖືກຕັ້ງເປັນ "specificity" ແລະ "trypsin/P". ຈຳນວນຕໍ່າສຸດຂອງ peptides ແລະ peptides razor ທີ່ໃຊ້ສຳລັບການກຳນົດໂປຣຕີນແມ່ນ 1; ຈຳນວນຕໍ່າສຸດຂອງ peptides ທີ່ເປັນເອກະລັກແມ່ນ 0. ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂຂອງການຈັບຄູ່ແຜນທີ່ peptide, ອັດຕາການກຳນົດໂປຣຕີນແມ່ນ 0.01. ຕົວເລືອກ "Second Peptide" ຖືກເປີດໃຊ້ງານ. ໃຊ້ຕົວເລືອກ “ການຈັບຄູ່ລະຫວ່າງການແລ່ນ” ເພື່ອໂອນການລະບຸຕົວຕົນທີ່ປະສົບຜົນສຳເລັດລະຫວ່າງໄຟລ໌ຕົ້ນສະບັບທີ່ແຕກຕ່າງກັນ. ໃຊ້ອັດຕາສ່ວນຂັ້ນຕ່ຳ LFQ ຈຳນວນ 1 ສຳລັບການວັດປະລິມານທີ່ບໍ່ມີປ້າຍ (LFQ) (60). ຄວາມເຂັ້ມຂອງ LFQ ຖືກກັ່ນຕອງສຳລັບຢ່າງໜ້ອຍສອງຄ່າທີ່ຖືກຕ້ອງໃນຢ່າງໜ້ອຍໜຶ່ງກຸ່ມ genotype ໃນແຕ່ລະຈຸດເວລາ, ແລະຖືກຄາດຄະເນຈາກການແຈກຢາຍປົກກະຕິທີ່ມີຄວາມກວ້າງ 0.3 ແລະຍ້າຍລົງ 1.8. ໃຊ້ແພລດຟອມຄອມພິວເຕີ Perseus (https://maxquant.net/perseus/) ແລະ R (https://r-project.org/) ເພື່ອວິເຄາະຜົນໄດ້ຮັບ LFQ. ການທົດສອບ t ປານກາງສອງທາງຈາກຊຸດຊອບແວ limma ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການວິເຄາະການສະແດງອອກທີ່ແຕກຕ່າງກັນ (61). ການວິເຄາະຂໍ້ມູນການສໍາຫຼວດແມ່ນປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally ແລະ pheatmap. ຂໍ້ມູນ proteomics ທີ່ອີງໃສ່ TMT ໄດ້ຖືກວິເຄາະໂດຍໃຊ້ MaxQuant ເວີຊັນ 1.6.10.43. ຄົ້ນຫາຂໍ້ມູນໂປຣຕີໂອມິກດິບຈາກຖານຂໍ້ມູນໂປຣຕີໂອມິກຂອງມະນຸດຂອງ UniProt, ເຊິ່ງໄດ້ຖືກດາວໂຫຼດໃນເດືອນກັນຍາ 2018. ການວິເຄາະປະກອບມີປັດໄຈການແກ້ໄຂຄວາມບໍລິສຸດຂອງໄອໂຊໂທບທີ່ຜູ້ຜະລິດສະໜອງໃຫ້. ໃຊ້ limma ໃນ R ສຳລັບການວິເຄາະການສະແດງອອກທີ່ແຕກຕ່າງກັນ. ຂໍ້ມູນຕົ້ນສະບັບ, ຜົນການຄົ້ນຫາຖານຂໍ້ມູນ, ແລະຂະບວນການເຮັດວຽກການວິເຄາະຂໍ້ມູນ ແລະຜົນໄດ້ຮັບທັງໝົດແມ່ນເກັບໄວ້ໃນພັນທະມິດ ProteomeXchange ຜ່ານບ່ອນເກັບມ້ຽນຄູ່ຮ່ວມງານ PRIDE ດ້ວຍຕົວລະບຸຊຸດຂໍ້ມູນ PXD019690.
ຄຳອະທິບາຍປະກອບໜ້າທີ່ເສີມສ້າງການວິເຄາະ. ເຄື່ອງມື Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອກໍານົດຄວາມອຸດົມສົມບູນຂອງເງື່ອນໄຂຄຳອະທິບາຍປະກອບໜ້າທີ່ຂອງຊຸດຂໍ້ມູນທີ່ 8 ອາທິດ (ຮູບທີ 1). ໂດຍຫຍໍ້, ລາຍຊື່ໂປຣຕີນປະລິມານທີ່ໄດ້ຮັບຈາກການວິເຄາະຂໍ້ມູນ LC-MS/MS (tandem mass spectrometry) ຖືກນໍາໃຊ້ດ້ວຍເງື່ອນໄຂການກັ່ນຕອງຕໍ່ໄປນີ້: Mus musculus ຖືກເລືອກເປັນຊະນິດ ແລະ ພື້ນຫລັງ, ແລະ ໝວດໝູ່ສະແດງຄ່າ P ທີ່ປັບໂດຍ Benjamini ສໍາລັບການເສີມສ້າງ 0.05 ຫຼື ຕໍ່າກວ່າຖືວ່າມີຄວາມສໍາຄັນ. ສໍາລັບກຣາຟນີ້, ຫ້າໝວດໝູ່ສ່ວນເກີນອັນດັບຕົ້ນໆໃນແຕ່ລະກຸ່ມໂດຍອີງໃສ່ຄ່າ P ທີ່ປັບແລ້ວແມ່ນສະແດງໃຫ້ເຫັນ. ໂດຍໃຊ້ການທົດສອບ t ຫຼາຍອັນ, ໂດຍໃຊ້ໂປຣແກຣມເພີ່ມເສັ້ນຊື່ສອງຂັ້ນຕອນຂອງ Benjamini, Krieger, ແລະ Yekutieli (Q = 5%), ການວິເຄາະການສະແດງອອກຂອງໂປຣຕີນຕາມໄລຍະເວລາແມ່ນປະຕິບັດກັບຜູ້ສະໝັກທີ່ສໍາຄັນທີ່ລະບຸໄວ້ໃນແຕ່ລະໝວດໝູ່, ແລະ ແຕ່ລະແຖວຖືກວິເຄາະແຍກຕ່າງຫາກ. ບໍ່ຈຳເປັນຕ້ອງຮັບຮອງເອົາ SD ທີ່ສອດຄ່ອງ.
ເພື່ອປຽບທຽບຜົນໄດ້ຮັບຂອງການສຶກສານີ້ກັບຖານຂໍ້ມູນທີ່ເຜີຍແຜ່ ແລະ ສ້າງແຜນວາດ Venn ໃນຮູບທີ 1, ພວກເຮົາໄດ້ລວມລາຍຊື່ໂປຣຕີນປະລິມານເຂົ້າກັບຄຳອະທິບາຍ MitoCarta 2.0 (24). ໃຊ້ເຄື່ອງມືອອນໄລນ໌ Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) ເພື່ອສ້າງແຜນວາດ.
ສຳລັບຂໍ້ມູນລະອຽດກ່ຽວກັບຂັ້ນຕອນທາງສະຖິຕິທີ່ໃຊ້ສຳລັບການວິເຄາະໂປຣຕີໂອມິກສ໌, ກະລຸນາອ້າງອີງໃສ່ພາກສ່ວນທີ່ສອດຄ້ອງກັນຂອງວັດສະດຸ ແລະ ວິທີການ. ສຳລັບການທົດລອງອື່ນໆທັງໝົດ, ຂໍ້ມູນລະອຽດສາມາດພົບໄດ້ໃນຄຳອະທິບາຍທີ່ສອດຄ້ອງກັນ. ເວັ້ນເສຍແຕ່ໄດ້ລະບຸໄວ້ເປັນຢ່າງອື່ນ, ຂໍ້ມູນທັງໝົດແມ່ນສະແດງເປັນຄ່າສະເລ່ຍ ± SEM, ແລະການວິເຄາະທາງສະຖິຕິທັງໝົດແມ່ນໄດ້ປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ຊອບແວ GraphPad Prism 8.1.2.
ສຳລັບເອກະສານເສີມສຳລັບບົດຄວາມນີ້, ກະລຸນາເບິ່ງ http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
ນີ້ແມ່ນບົດຄວາມທີ່ສາມາດເຂົ້າເຖິງໄດ້ໂດຍບໍ່ເສຍຄ່າ ເຊິ່ງແຈກຢາຍພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂຂອງໃບອະນຸຍາດ Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, ເຊິ່ງອະນຸຍາດໃຫ້ນຳໃຊ້, ແຈກຢາຍ ແລະ ສຳເນົາໃນສື່ໃດກໍໄດ້, ຕາບໃດທີ່ການນຳໃຊ້ສຸດທ້າຍບໍ່ແມ່ນເພື່ອຜົນປະໂຫຍດທາງການຄ້າ ແລະ ຫຼັກຖານແມ່ນວ່າຜົນງານຕົ້ນສະບັບຖືກຕ້ອງ. ອ້າງອີງ.
ໝາຍເຫດ: ພວກເຮົາພຽງແຕ່ຂໍໃຫ້ທ່ານໃຫ້ທີ່ຢູ່ອີເມວຂອງທ່ານເພື່ອໃຫ້ບຸກຄົນທີ່ທ່ານແນະນຳໃຫ້ກັບໜ້າເວັບຮູ້ວ່າທ່ານຕ້ອງການໃຫ້ເຂົາເຈົ້າເຫັນອີເມວ ແລະ ມັນບໍ່ແມ່ນສະແປມ. ພວກເຮົາຈະບໍ່ບັນທຶກທີ່ຢູ່ອີເມວໃດໆ.
ຄຳຖາມນີ້ແມ່ນໃຊ້ເພື່ອທົດສອບວ່າທ່ານເປັນຜູ້ມາຢ້ຽມຊົມຫຼືບໍ່ ແລະ ປ້ອງກັນການສົ່ງສະແປມໂດຍອັດຕະໂນມັດ.
ໂດຍ E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
ການວິເຄາະໂປຣຕີໂອມິກຂອງເຊວປະສາດທີ່ຜິດປົກກະຕິໄດ້ເປີດເຜີຍວ່າໂປຣແກຣມການເຜົາຜານອາຫານໄດ້ຖືກກະຕຸ້ນເພື່ອຕ້ານກັບການເສື່ອມສະພາບຂອງເຊວປະສາດ.
ໂດຍ E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
ການວິເຄາະໂປຣຕີໂອມິກຂອງເຊວປະສາດທີ່ຜິດປົກກະຕິໄດ້ເປີດເຜີຍວ່າໂປຣແກຣມການເຜົາຜານອາຫານໄດ້ຖືກກະຕຸ້ນເພື່ອຕ້ານກັບການເສື່ອມສະພາບຂອງເຊວປະສາດ.
© 2020 ສະມາຄົມອາເມລິກາເພື່ອຄວາມກ້າວໜ້າຂອງວິທະຍາສາດ. ສະຫງວນລິຂະສິດທັງໝົດ. AAAS ເປັນຄູ່ຮ່ວມງານຂອງ HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ແລະ COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.